尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）和CYP2A6基因多态性与中国南方男性人群肺癌易感性的关联研究

发布时间：2020-10-27 15:38

　　 研究背景和目的：肺癌是世界上发病率及死亡率增长最快的恶性肿瘤,并且继续在上升,在中国和在大多数工业化国家中,肺癌已居各类恶性肿瘤死因的第一位。肺癌的产生是环境-遗传因素共同作用所致,但具体的发病机制还没有彻底明晰,但流行病学数据显示在环境危险因素中,吸烟与肺癌发生发的风险关系最密切,吸烟者罹患肺癌的风险是非吸烟者的20倍,肺癌患者中80%以上与烟草依赖或成瘾行为有关。与此同时,另外一种现象值得我们注意,就是吸烟者中却仅有10%～15%会发生肺癌。这表明个体对肺癌的易感性存在差异,而导致这种差异的原因来源于遗传的多态性。对于研究复杂性疾病的遗传易感性比如肺癌,全基因组关联研究(Genome-wide association studies, GWAS)是一种有效的手段,为研究者打开了一扇通往研究复杂疾病的大门。GWAS是在研究的目标人群中设病例组和对照组,使用单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)作为两组关联分析的遗传标记,对照分析两组间的全基因组差别,进而有希望发现影响疾病发生的遗传特征。如果病例组较对照组相比,病例组中出现了某个SNP位点的等位基因或基因型出现的频率显著改变,则认为SNP位点可能与疾病的发病风险相关,最后,研究者通过基因定位和连锁不平衡分析确定疾病可能的易感基因。目前在全世界范围内进行的GWAS已经为肺癌筛选出一批遗传易感性相关的常见基因变异,例如尼古丁乙酰胆碱受体和CYP2A6功能相关的基因变异位点,这些位点的遗传多态性可增加或降低个体罹患肺癌的风险。以上研究结果提示通过检测与罹患肺癌风险相关的遗传学分子标志,有助于进行肺癌病因学研究及筛选肺癌高危人群。单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA中由于某个单个核苷酸发生转换、颠倒、插入或缺失等变异所引起的DNA序列多态性。SNP在人类基因组中具有数量众多、分布广泛和稳定遗传等特点,SNP可能发生在基因的编码序列上,亦可发生在非编码序列上。根据SNP在基因中的不同位置,可分为基因调控区单核苷酸多态性(Regulatory SNP,rSNP)和基因编码区单核苷酸多态性(Coding SNP, cSNP)。根据基因编码区SNP是否改变编码的氨基酸序列,cSNP又可分为同义cSNP (Synonymous cSNP)和非同义cSNP (Non-synonymous cSNP)。同义cSNP指碱基序列的改变并不引起蛋白质的氨基酸序列变化；非同义cSNP的变异可以改变编码的氨基酸残基的种类,进而引起蛋白质结构和功能的变化。另外,rSNP则可以通过影响与转录因子或miRNA的结合,引起基因表达水平的改变或mRNA的稳定性及翻译过程的变化,进而影响细胞正常功能。总的来说,这些潜在功能性SNPs通常会被优选用来探讨与疾病发生发展及预后的关系,进而为包括肺癌在内的恶性肿瘤的防治及临床治疗策略提供科学依据。SNP与肺癌易感性关系的研究是目前肺癌研究领域的一个热点,并且在世界多个地区进行的GWAS已经寻找到一些影响肺癌发病风险的易感基因位点和染色体区域。例如,尼古丁基因家族成员CHRNA3、CHRNB4、CHRNB2 (cholinergic receptor, nicotinic, α3,β4 and β2)可编码烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs),与个体的吸烟行为有关。过去研究认为nAChRs仅存在于神经系统,但是最近研究已证实,nAChRs也分布在肺支气管上皮细胞上,而且在肺癌的产生过程中发挥重要作用。烟碱型乙酰胆碱受体属于配体门控离子通道超家族,可被乙酰胆碱、胆碱和尼古丁激活,参与尼古丁和烟草亚硝胺的调节,而尼古丁和烟草亚硝胺正是吸烟相关肺癌的主要致癌物。此外,尼古丁与细胞表面的nAChRs受体蛋白结合,通过多种途径影响肿瘤的进展,如细胞增殖、侵袭和间质血管的生成,同时还能保护肿瘤细胞逃避程序性死亡,发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用。CHRNA3基因编码的乙酰胆碱α3亚基蛋白能结合烟草专有的致癌物NNK,导致癌基因的激活,从而促进肿瘤细胞的增殖,增加机体罹患肺癌风险。此外,别的致癌物质如亚硝胺作用于nAChRs蛋白后,能促进肿瘤血管和肿瘤细胞生长,与肿瘤发生、发展有关。来自冰岛、法国、美国和英国的独立GWAS结果亦证实遗传易感性与肺癌的发病风险关系密切。四组研究人员通过对肺癌患者和健康人群的病例-对照分析,均验证了染色体15q24-25区域编码：nAChR:基因家族的多个SNPs位点多态性对肺癌发病风险的影响作用。然而,在韩国、日本及中国人群中的研究却未能重复该实验结果,其原因可能是因为这些多态性位点的最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)分布在亚洲人群中较低。以上的研究结果提示肺癌的易感基因位点的分布存在着种族和地域的不同。因此,在我国人群中进行基因多态性与肺癌发病关联的研究是非常有必要的,我们可以从中寻找出中国人群的肺癌易感位点,为我国肺癌高危人群的筛查以及个体化预防和治疗奠定数据基础和理论依据。位于染色体1q21区域的CHRNB2 (cholinergic receptor nicotinicβ2)基因、位于15q25.1区域的CHRNA3基因和CHRNB4基因(cholinergic receptor nicotinic α3 and β4)及位于20q13.2区域的基因CHRNA4(cholinergic receptor nicotinic α4。以上基因编码的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)可能会影响个体吸烟行为和烟草成瘾性,也涉及烟草致癌物的信号转导通路的调控,可以抑制细胞凋亡、促进肿瘤增殖,与肺癌的发生关系密切。尽管在欧美及亚洲人群中均有该基因家族的变异位点与肺癌的发病风险关联的报道,但产生该关联的机制是直接作用于癌变的分子通路还是通过影响吸烟行为间接作用于癌变的分子通路,亦或是二者的协同作用所致,目前尚无定论。尼古丁受体基因家族的位点发生突变,结果可能增加个体的吸烟量,故研究人员认为,基因多态性影响吸烟行为,从而提高机体肺癌产生的风险。例如日本研究结果发现1q21区域的rs4845652 T等位基因携带者有较低的尼古丁依赖性(nicotine dependence,Nd),同时证明了CHRNA4、CHRNB2基因与基因的相互作用影响Nd,比如那些同时携带有CHRNA4rs1044397 GG或GA基因型和CHRNB2 CC基因型的吸烟者Nd较高。另外冰岛的GWAS研究结果发现染色体15q24-25区域上rs1051730位点的遗传变异与烟草成瘾行为有关,可导致个体的吸烟量及罹患肺癌的风险增加。然而,欧美学者进行的GWAS却得出了不同的结论,其研究结果表明染色体15q25区域rs1051730和rs8034191位点的多态性变化与吸烟量及Nd无关。CYP2A6基因位于人类19号染色体长臂的19q12-19q13.2区域,超过6000个碱基对,包含9个外显子,编码494个氨基酸,其编码香豆素7-羟化酶,在生理过程药物代谢及毒物代谢中发挥着重要的作用,特别是在外源性化学物质的代谢中,参与许多前致癌物的代谢活化,例如黄曲霉毒素B1,亚硝胺,1,3-丁二烯等。CYP2A6是表达在人类呼吸道中的P450酶,负责将烟草中大量的致癌物质如NNK、NNAL、NNN等强致癌物活化,而NNK是TSNA中最强的一种致癌物,也是烟草中含量最多的肺致癌物,对肺组织有高度的亲和性,被认为是烟草中可能引起肺癌重要成分之一。CYP2A6可能以缺失和重复基因的形式存在,另外它还包含了基因转换、核苷酸缺失、核苷酸插入以及单核苷酸多态性(SNP)的形式。根据CYP2A6对其特异底物的代谢能力不同,分为强代谢个体(EMs)和弱代谢(PMs)个体。影响CYP2A6活性一个重要因素就是其的基因多态性,目前有近30种的CYP2A6基因突变被发现,CYP2A6*1是野生型纯合子。CYP2A6*2是L160H的突变,被认为是导致欧洲人群弱代谢个体的主要突变。CYP2A6*3是基因转位引起的变异,而CYP2A6*4是基因3非编码区域的缺失引起的变异,也被认为是导致亚洲人群中弱代谢个体的主要突变类型,频率高达15%-20%,我国研究者在CYP2A6表型的研究中就发现中国人群PMs频率高达13.3%,与CYP2A6*4在亚洲人群高频率突变有一定关系。CYP2A6等位基因频率在不同种族之间的分布存在很大差别,大多数等位基因在亚洲人群中的频率较高。另外,根据CYP2A6基因型把CYP2A6对尼古丁的代谢能力分为正常代谢(normal,100%)、中间代谢(intermediate,75%左右)、慢代谢(slow,50%-25%)、低代谢(poor,25%)四组。目前在不同种族进行关于CYP2A6和肺癌易感性的研究,出现的不一致甚至矛盾的结果。基于以上研究结果的不一致性,有必要在不同种族及不同吸烟状态的人群中对基因多态性与肺癌发病的关联进行验证,并探讨遗传风险和其他环境因素对易感基因功能的可能影响。目前,虽然肺癌的易感基因研究已取得很大进展,但大部分数据是以西方人群为基础,有关中国汉族人群的研究数据仍十分缺乏,因此针对中国人群肺癌的病因学研究尤为重要。本课题旨在通过病例-对照分析,探讨染色体nAChR基因SNP和CYP2A6基因多态性与中国南方男性肺癌发病的相关性,从而为肺癌高危人群的筛查、早期诊断和个体化治疗提供理论依据和数据基础。实验将研究对象限定在中国南方男性肺癌患者,挑选出了5个肺癌可能易感的尼古丁乙酰胆碱受体SNP位点,同时选择了CYP2A6五个多态性位点检测。利用iMLDR技术在中国南方肺癌患者和健康对照者中进行mAChR基因多态性分型；同时采用多重LONG-PCR电泳与SNaPshot相结合的方法对CYP2A6进行基因多态性检测并整理检测结果,利用SPSS13.0软件进行相关统计分析。探讨各个位点的多态性分布与肺癌患病风险的关系,验证中国南方男性肺癌易感SNP位点。综合以上数据为中国南方男性肺癌高危人群的确定及个体化预防和治疗奠定初步的数据基础和理论依据,也为下一步建立适合中国南方男性的肺癌易感基因风险评估模型做准备。研究方法：1.研究对象病例组来源于2013年5月至10月在广州医科大学附属第一医院收集的经病理证实为肺癌的204例患者。对照组为来自同期体检中心无肿瘤病史及相关肺疾病的健康人群821例。研究对象均来源于中国南方男性,采集所有研究对象外周血样本。2.SNP位点的挑选从NCBI的SNP信息数据库、全基因组关联分析以及其它国内外大样本研究得到的阳性位点中挑选出了5个肺癌可能易感的尼古丁乙酰胆碱受体SNP位点,具体为：位于CHRNA3基因的rs6495308；位于CHRNB4基因的rs11072768；位于CHRNA4基因的rs3787140及位于CHRNB2基因的rs2072659和rs2072660；同时选择了CYP2A6*4、CYP2A6*5、CYP2A6*7、 CYP2A6*9和CYP2A6*10五个CYP2A6多态性位点检测。3.基因分型与数据分析利用iMLDR技术在中国南方肺癌患者和健康对照者中进行nAChR基因多态性分型：同时采用多重LONG-PCR电泳与SNaPshot相结合的方法对CYP2A6进行基因多态性检测并整理检测结果,利用SPSS13.0软件进行相关统计分析。探讨各个位点的多态性分布与肺癌患病风险的关系,验证中国南方男性肺癌易感SNP位点。4.对各位点多态性与肺癌患者的吸烟状态、病理类型、解剖位置等相关性进行分析；探讨基因型分布与吸烟行为在肺癌中的交互作用。5.探讨nAChR基因多态性之间、nAChR与CYP2A6基因多态性之间对肺癌发生存在的交互作用。结果：第一部分nAChR和CYP2A6基因多态性与肺癌发生的关系本研究选取了尼古丁乙酰胆碱受体基因的5个SNPs位点,在204例南方男性肺癌患者和821例健康对照人群中进行了基因分型和统计分析。结果显示,除rs11072768外,其它4个位点的基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),病例对照分析发现1个与肺癌发病风险相关的多态性位点,即位于CHRNB2基因上的rs2072660位点,与C/C基因型相比,C/T基因型携带者的肺癌发生的风险升高,OR值(95%CI)为1.708(1.169-2.496),P=0.006。本研究对204例南方男性肺癌患者和821例健康对照人群中的CYP2A6代谢分型进行统计分析。结果显示,与正常代谢组相比,中间代谢组、慢代谢组肺癌发生的风险降低,OR值(95%CI)分别为0.142(0.041-0.485),P0.001、0.561(0.316-0.996),P0.048。低代谢组肺癌发生的风险升高,OR值(95%CI)为2.334(1.552-3.581),P0.001。本研究分析结果显示对肺癌组各基因多态性与患者的病理类型无关；但就解剖位置而言,CHRNB2 rs2072659的G/G基因型可增加发生非周围型肺癌的风险,OR值(95% CI)为8.360(1.153-60.623), CYP2A6低代谢型发生周围型肺癌的风险降低,OR值(95% CI)为0.453(0.223-0.921)。第二部分nAChR和CYP2A6基因多态性及基因型-基因型间的交互作用对吸烟行为的影响本研究分析结果显示CHRNB2rs2072660 C/T基因型较C/C基因型相比,发生吸烟的风险降低(OR=0.710,95%CI=0.530-0.953);另外相对于CYP2A6正常代谢型而言,中间代谢(OR=5.809,95%CI=0.2611-12.924)、慢代谢型(OR=1.713,95%CI=1.107-2.649)者吸烟的风险增加,而低代谢型(OR=0.466,95%CI=0.338-0.643)者发生吸烟的风险降低。同时,进一步交互作用分析结果显示CHRNA3rs6495308C/T基因型并CYP2A6代谢分型为低代谢者对吸烟行为的发生存在正交互作用(OR=2.000,95%CI:1.021-3.919),表明两者同时存在的个体吸烟行为风险增加。其余基因型之间对吸烟行为不存在交互作用。第三部分吸烟、nAChR、CYP2A6基因多态性三者间对肺癌发生的交互作用本研究对nAChR基因多态性之间对肺癌的交互作用、nAChR与CYP2A6基因多态性之间对肺癌的交互作用、吸烟与nAChR基因多态性之间对肺癌的交互作用、吸烟与CYP2A6基因多态性之间对肺癌的交互作用进行了分析。多因素logistic回归分析结果表明：在控制年龄、职业、文化程度、吸烟和婚姻状况等混杂因素之后,CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072659G/C基因型者、CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNA4rs3787140C/T基因型者CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072660C/T基因型者对肺癌的发生均存在负交互作用,OR值分别为0.378 (95%CI:0.170～0.841)、0.268 (95%CI: 0.107～0.670)、0.277 (95%CI:0.124～0.620)。在控制年龄、职业、文化程度和婚姻状况等混杂因素之后,CYP2A6代谢分型为低代谢并每天吸烟0-15支者(OR=13.194,95%CI:2.394～72.716)、CYP2A6代谢分型为低代谢并每天吸烟15支者(OR=4.348,95%CI:1.672～11.308)对肺癌的发生存在正交互作用。其余不存在交互作用。结论：1. 本研究结果显示位于CHRNB2基因rs2072660位点与中国南方男性肺癌发生的风险相关,其中rs2072660位点C/T基因型可能增加个体肺癌发生的风险；CHRNB2 rs2072659的G/G型可增高发生非周围型肺癌的风险,CYP2A61氏代谢型发生周围型肺癌的风险降低；CHRNB2rs2072660 C/T基因型发生吸烟的风险降低,CYP2A6中间代谢、慢代谢型者吸烟的风险增加,而低代谢型者发生吸烟的风险降低。2. 交互作用分析结果显示,CHRNA3rs6495308 C/T基因型并CYP2A6低代谢型者对吸烟行为的发生存在正交互作用；CHRNB2 rs2072660基因多态性与CHRNA3 rs6495308基因多态性对肺癌存在负交互作用,CHRNA3rs6495308基因多态性与CHRNB2 rs2072659基因多态性对肺癌存在负交互作用,CHRNA3 rs6495308基因多态性与CHRNA4 rs3787140基因多态性对肺癌负交互作用,CYP2A6基因多态性与吸烟行为对肺癌存在正交互作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

ＡＢＩＳＮＰｋｘＴＭ?Ａｓｓａｙ?等。??本研究中对于ｎＡＣｈＲ基因多态性的检测采用的方法是ｉＭＬＤＲ技术，该技??术的原理为（图３）；首先对于突变所在区段先采用多重ＰＣＲ反应在一个体系??中获得扩增。扩增产物经过外切核酸酶及邮碱酶（ＥｘｏＩ／ＳＡＰ）纯化后用于后续??１５??

Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?出ｅ?ｉＭＬＤ民化ｃｈｎｏｌｏｇｙ??对于ＣＹＰ２Ａ６基因多态性的检测我们采用多重ＬＯＮＧ－ＰＣ民电泳与??ＳＮａＰｓｈｏｔ相结合的方法。ＳＮａＰｓｈｏｔ技术原理（见图４）是首先使用引物扩增目??标ＳＮＰｓ所在片段，在扩增产物中加入核酸外切酶Ｉ?（Ｅｘｏ?Ｉ）和碱性磯酸酶??（Ｓｈｒｉｍｐ?Ａｌｋａｌｉｎｅ?Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，?ＳＡＰ）消化掉反应体系中的引物序列和剩余的??脚ＴＰｓ；然后，Ｗ纯化后的扩増产物为模板，使用测序酶、四种炎光标记ｄｄＮＴＰ??和５＇－端紧靠ＳＮＰ位点的延伸引物进行ＰＣＲ反应，引物延伸一个碱基即终止，??经ＡＢＩ测序仪检测后，按照峰的移动位置确定该延伸产物对应的ＳＮＰ位点，根??据峰的颜色可得知惨入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。其优点在于：??１．分型准确；２．通量高：也称小测序；３．检测速度快；４．不受ＳＮＰ位点多态性特??性限制；５．不受样本个数限制。??１７??

图５?ＳＮａＰｓｈｏｔ毛细管电泳峰形图??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｃａｐｉｌｌａｒｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｅａｋ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ＳＮａＰｓｈｏｔ??ｆ．统计分析??

本文编号：2858712