Notch信号通路在TGF-β1诱导的胃癌细胞EMT中的作用

发布时间：2020-10-31 16:04

　　 胃癌是最常见的恶性肿瘤,尽管它在全球范围内的发病率呈下降趋势,但其死亡率仍高居不下。临床运用了大量常规与靶向治疗,但多数胃癌病人被确诊时已出现肿瘤转移。因此,探究与肿瘤侵袭转移相关的重要信号通路及传导机制,将有利于胃癌的早期诊断及靶向治疗。Notch信号通路在遗传进化上十分保守,在细胞分化增殖、凋亡和干细胞的自我更新等方面发挥了重要作用。研究显示,它与肿瘤的侵袭、转移、复发、低生存率及不良预后等密切相关。近年来,大量研究证实它在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中也发挥了重要作用。Notch信号通路在相邻细胞间发挥作用,不需要第二信使的参与。当Notch受体与邻近细胞膜上配体Jagged1结合而被激活后,释放Notch受体的胞内区域(Notch intracellular domain,NICD),后者继而转位于细胞核中,与转录复合体相互作用,激活Notch通路的下游靶基因。EMT是上皮来源的恶性肿瘤表达恶性行为的重要方式,在肿瘤侵袭转移方面发挥重要作用。其特征为:上皮细胞间连接被破坏,失去细胞极性,上皮细胞表型转化为间质细胞表型。除此之外,EMT过程最重要的改变是,它使肿瘤细胞获得更强的运动能力。上皮性标志基因E-cadherin的缺失是EMT事件的标志性变化,间质性标志基因有Vimentin、N-cadherin等,可通过检测这些标记基因的表达水平来验证EMT的发生。研究表明,在肿瘤微环境中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以刺激血管生成、促进细胞外基质沉积并增加蛋白水解酶的合成。TGF-β1在细胞分化、增殖、凋亡及运动能力等方面发挥重要作用。它在各种病理条件下大量表达,如慢性炎症和肿瘤。多方研究证实,肿瘤微环境的改变如缺氧或TGF-β1增高,可以诱发多种类型的上皮细胞发生EMT。目前,Notch信号在胃癌上皮间质中的作用尚未阐明,探讨其中的作用机制,或将有益于胃癌的诊疗。目的采用荧光定量PCR实验(Real time-PCR)、免疫印迹实验(Western Blot)和Transwell侵袭实验检测在空白对照组、诱导组、阴性转染组及转染组中Jagged1、N1ICD、E-cadherin和Vimentin等基因的表达量,以及处理前后细胞侵袭性的变化,初步探讨Notch信号通路在TGF-β1诱导的胃癌EMT中的作用及其对细胞侵袭性的影响。材料和方法1研究对象选择胃癌细胞株SGC7901,使用RPMI 1640和FBS按9:1配置的完全培养基,将细胞置于37℃、5%CO_2的恒温培养箱进行培养。2方法待细胞生长至覆盖培养瓶底约80%时,将其随机分为四组,即空白对照组、诱导组、阴性对照组、转染组。其中,空白对照组不做任何处理,诱导组采用浓度为10ng/ml的TGF-β1诱导胃癌细胞24h,转染组瞬时转染Jagged1的siRNA,阴性对照组转染无义siRNA序列,转染组和阴性对照组转染48h后再用10ng/ml的TGF-β1诱导细胞24h。采用Real time PCR实验检测各组中E-cadherin、Vimentin及Jagged1 mRNA的表达水平,用Western Blot实验检测各组中E-cadherin、Vimentin、Jagged1及N1ICD蛋白的表达水平。Transwell侵袭实验用于检测各组中细胞侵袭能力的变化。3统计学分析应用SPSS21.0软件进行数据处理及分析,用?x±s表述定量资料数据,两组间比较采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析,以α=0.05为检验水准。结果1 TGF-β1诱导后对SGC7901细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响Western Blot结果表明,诱导组E-cadherin的蛋白表达量为0.15±0.12,较空白对照组的0.54±0.09显著下降;诱导组Vimentin的蛋白表达量为0.81±0.20,较空白对照组的0.58±0.08显著上升,差异均有统计学意义(P0.05)。2 TGF-β1诱导后对SGC7901细胞Jagged1和N1ICD表达的影响2.1 TGF-β1诱导后对SGC7901细胞Jagged1 mRNA的相对表达水平的影响TGF-β1诱导处理后,荧光定量PCR结果显示诱导组Jagged1 mRNA的相对表达水平为1.59±0.20,与空白对照组相比,诱导组Jagged1的mRNA表达水平上调,差异有统计学意义(P0.05)。2.2 TGF-β1诱导后对SGC7901细胞Jagged1和N1ICD蛋白的表达量的影响用Western Blot检测Jagged1和N1ICD的蛋白表达水平结果表明,空白对照组Jagged1的蛋白相对表达量为0.36±0.22,诱导组为0.61±0.20,与空白对照组相比,诱导组Jagged1蛋白的表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);诱导组N1ICD的蛋白表达水平为0.74±0.19,较空白对照组(0.30±0.18)升高,差异具有统计学意义(P0.05)。3转染Jagged1 siRNA并诱导处理后对SGC7901细胞N1ICD、E-cadherin和Vimentin表达的影响3.1转染Jagged1 siRNA并诱导处理后对细胞E-cadherin和Vimentin mRNA表达的影响对SGC7901细胞进行瞬时转染Jagged1的siRNA后再用TGF-β1诱导处理,用荧光定量PCR技术检测Jagged1、E-cadherin和Vimentin mRNA的相对表达水平。结果显示,转染组Jagged1的mRNA相对表达水平为0.61±0.04,较阴性对照组(1.48±0.03)、诱导组(1.36±0.18)和空白对照组(1.00±0.00)显著降低;转染组中E-cadherin的mRNA相对表达量为1.64±0.03,较阴性对照组(0.38±0.12)、诱导组(0.40±0.39)和空白对照组(1.00±0.00)升高,转染组中Vimentin mRNA相对表达量为0.43±0.28,较阴性对照组(1.67±0.04)、诱导组(1.61±0.03)和空白对照组(1.00±0.00)降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。3.2转染Jagged1 siRNA并诱导处理后对SGC7901细胞N1ICD、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响用Western Blot检测N1ICD、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达情况,结果表明:转染组N1ICD的蛋白表达水平为0.22±0.12,较阴性对照组(0.79±0.30)、诱导组(0.77±0.19)和空白对照组(0.41±0.21)下降;转染组E-cadherin的蛋白表达水平为0.95±0.19,较阴性对照组(0.15±0.27)、诱导组(0.18±0.13)和空白对照组(0.47±0.02)升高;转染组Vimentin的蛋白表达量为0.21±0.32,较阴性对照组(0.82±0.19)、诱导组(0.79±0.26)和空白对照组(0.54±0.04)下降,差异均具有统计学意义(P0.05)。4各处理组SGC7901细胞侵袭能力的改变采用Transwell侵袭实验检测各组胃癌SGC7901细胞侵袭能力的变化。TGF-β1诱导后发生侵袭的细胞数为74.67±2.60,空白对照组为55.0±2.65,诱导组侵袭的细胞数高于对照组,两组的差异有统计学意义(P0.05)。转染组中侵袭细胞数目为36.33±4.73,阴性对照组为77.33±3.79,与阴性对照组和空白对照组相比,转染组的发生侵袭的细胞数明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论TGF-β_1可能通过上调Notch信号通路而诱导胃癌细胞发生EMT,并增强胃癌细胞的侵袭能力,提示Notch信号通路可能在胃癌侵袭方面发挥重要作用。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

F-β1 诱导处理细胞 24h 后，采用 的蛋白表达水平，结果表明：诱导下降，诱导组 Vimentin 的蛋白表学意义(P<0.05)，(见表 3.1 和图 3诱导胃癌 SGC7901 细胞发生了 E导后细胞 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白N E-cadherin 9 0.54 ± 0.09 9 0.15 ±0.12* 14.274 <0.001 ：*表示与空白对照组相比，P<0.05。

1 诱导后对 SGC7901 细胞 Jagged1 和 N1ICD1 诱导后对 SGC7901 细胞 Jagged1 mRNA 相对表达ml 的 TGF-β1 诱导细胞 24h 后，荧光定量 PCR 结A 的相对表达水平为 1.59±0.20，与空白对照组相比，水平上调，差异有统计学意义(P<0.05)，(见表 3.2.2 TGF-β1 诱导后细胞 Jagged1 mRNA 的相对表达情况( 注：*表示与空白对照组相比，P<0.05。组别 N Jagged1 mRNA空白对照组 9 1.00±0.00诱导组 9 1.59±0.20*t -29.175P <0.001

诱导组 Jagged1 的蛋白表达的蛋白表达水平分别为0.30±0.18，0.7对照组升高，差异具有统计学意义(PICD 分子水平的表达升高表明 TGF-β1相互作用。-β1 诱导后细胞 Jagged1 和 N1ICD 的蛋白表N Jagged1 N1ICD9 0.36±0.22 0.30±09 0.61±0.20* 0.74±0-7.646 -10.40.002 <0.0注：*表示与空白对照组相比，（P<0.05）。
【参考文献】

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1 尉阳;王蕾蕾;尚涛;;靶向沉默Notch-1基因抑制滋养细胞上皮间质转化的机制研究[J];中国医科大学学报;2015年03期

2 Michaela Aichler;Birgit Luber;Florian Lordick;Axel Walch;;Proteomic and metabolic prediction of response to therapy in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年38期

3 Bing Yan;Long Liu;Ying Zhao;Li-Juan Xiu;Da-Zhi Sun;Xuan Liu;Ye Lu;Jun Shi;Yin-Cheng Zhang;Yong-Jin Li;Xiao-Wei Wang;Yu-Qi Zhou;Shou-Han Feng;Can Lv;Pin-Kang Wei;Zhi-Feng Qin;;Xiaotan Sanjie decoction attenuates tumor angiogenesis by manipulating Notch-1-regulated proliferation of gastric cancer stem-like cells[J];World Journal of Gastroenterology;2014年36期

4 陈剑辉;吴晖;马晋平;陈创奇;蔡世荣;何裕隆;;抑制胃癌Hedgehog通路对转化生长因子β诱导的上皮间质化的影响[J];中华医学杂志;2013年26期

5 Danielle Queiroz Calcagno;Carolina Oliveira Gigek;Elizabeth Suchi Chen;Rommel Rodriguez Burbano;Marília de Arruda Cardoso Smith;;DNA and histone methylation in gastric carcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2013年08期

本文编号：2864172