抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的益生菌筛选及其作用机理研究

发布时间：2020-11-01 14:06

　　 结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是发生在人体下消化道的一种癌症,包括结肠癌和直肠癌。CRC的发病率在全球范围内高居不下,居癌症发病率的第三位。在我国,随着生活水平的提高以及生活习惯的西化,结直肠癌的发病率也在逐年递增。传统的手术治疗辅以化学药物治疗和放射线治疗,对患者的毒副作用大,虽然提高了五年生存率,但是严重影响患者的生活质量;靶向治疗的方法存在天然或获得性耐药;免疫治疗可能会并含某些不可预知的并发症;而基因治疗存在导入率低、成本高等问题,所以寻找一种安全可靠毒副作用小的治疗方式成为主要研究方向。益生菌是一类寄居在人体肠道和生殖系统内的活的微生物,对人体健康有益。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是益生菌的主要成员,且在近年研究中发现乳酸菌不仅具有改善物质风味,天然防腐抑菌等功能,还能维持宿主体内的微生态平衡,保护宿主肠道健康;刺激宿主免疫,预防宿主癌症的发生。所以使用益生菌进行预防或辅助治疗CRC可能正是我们所寻求的安全可靠毒副作用小的治疗方式之一。本研究主要从云南传统发酵食品中分离得到的乳酸菌,并挑选10株菌进行抑制结直肠癌细胞HT-29增殖功能的筛选。益生菌的代谢产物(即发酵上清)制成冻干粉溶液后,用于处理HT-29细胞,并用MTT的方法检测细胞活力,计算细胞存活率,用于评估乳酸菌的抗增殖能力,最后筛选出两株具有良好抑制效果的菌株。使用其它结直肠癌细胞系对这两株菌进一步筛选;筛选出来的乳酸菌处理HT-29细胞后,使用流式细胞仪检测处理后细胞的细胞周期和凋亡情况,最后挑选出一株抗增殖效果最好的乳酸菌,并对其抗HT-29细胞增殖的机理进行深入研究。转录组学的方法从分子水平上能够了解HT-29细胞基因表达的整体情况,并预测其抗增殖作用的分子机理。主要研究内容和实验结果如下:1.从实验室自主分离保存的菌种中挑选10株用于实验,分别是Lactobacillus fermentum JSL8-2(发酵乳杆菌JSL8-2)、Pediococcus pentosus 2-4L(戊糖片球菌2-4L)、Lactobacillus plantarum AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3(植物乳杆菌AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3)、Lactococcus latics BZ06(乳酸乳球菌BZ06)、Lactobacillus casei AS02(干酪乳杆菌AS02)、Lactobacillus brevis 3M(短乳杆菌3M)、Lactobacillus curvatus 6M(弯曲乳杆菌6M),乳酸菌的发酵上清制成冻干粉,使用细胞培养基重悬成溶液后,稀释成不同浓度处理HT-29细胞,MTT方法检测细胞活力,最后筛选出两株具有良好抗增殖效果的菌株AY01和JSL8-2。2.不同浓度的AY01和JSL8-2处理HT-29细胞后,结果显示,随着冻干粉溶液浓度的增加,菌株的抗增殖效果越好,且在64 mg/mL和128 mg/mL的浓度下,抑制效果最好。此外,随着处理时间的增加,抗增殖效果也越好,且在48 h和60 h时抑制效果达到最佳,但在这两个时间点上,抑制效果没有明显差异3.分别用不同浓度的AY01和JSL8-2的冻干粉溶液处理CRC细胞株Caco-2、HCT116、SW620,用MTT法检测细胞活力,AY01和JSL8-2对其它CRC细胞株也具有抗增殖的作用,且在浓度为64 mg/mL和128 mg/mL时效果最好,培养时间达到48 h和60 h时抑制效果也最好。4.使用流式细胞仪检测AY01和JSL8-2处理HT-29细胞后的细胞周期和凋亡情况,从细胞水平上评估这两株菌的抗增殖能力。研究发现,AY01和JSL8-2都是通过诱导细胞凋亡实现抗增殖作用的,而不是通过阻滞细胞周期;此外,我们发现,AY01的诱导凋亡能力较JSL8-2的更强,所以最终选定的菌株为AY01。5.根据流式细胞仪的检测结果,32 mg/mL的AY01冻干粉溶液处理HT-29细胞,使用转录组学的方式探究细胞内的基因表达情况,结果显示,与细胞凋亡相关的基因表达差异较大,正好与流式细胞仪的结果相一致。6.转录组数据分析显示,AY01作用于HT-29细胞,主要是通过两条信号通路,TGF-β/smad信号通路和Ferroptosis死亡途径,实现细胞周期的阻滞、诱导细胞凋亡、细胞自噬以及Ferroptosis死亡。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

图 1 CRC 发生及发展示意图.2.1 CRC 的发生与肠道微生物肠道微生物是指集聚人体或动物体结肠、直肠等下消化道内的微生物。人类的肠道中集着大量的微生物，占人体总微生物量的 78%，其数量高达 1014cfu，大约是人体真核细的 10 倍。随着科学研究的深入，科学家们发现肠道微生物在人类健康方面发挥着重要用，尤以肠道相关疾病最甚，包括炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）、溃疡结肠炎（Ulcreative colitis, UC）、CRC 等等。近年，许多研究均证实，与对照相比，CRC 患者的肠道群落结构发生改变，其中与RC 发生相关的促炎机会致病菌显著增多，如具核梭杆菌属、肠球菌科和弯曲杆菌属等[7, 8]。于此，Tjalsma 等[9]提出肠道菌群致癌的“Driver-Passenger”模型：某些特定的肠道固有菌过诱导肠上皮细胞染色体不稳定、免疫炎症反应参与肿瘤的早期形成，这些肠道固有细被定义为 “drivers” 菌；其次，癌变过程介导了肠道微环境的改变，drivers 菌慢慢被其

图 2 CRC 细胞凋亡机制.3 饮食、生活习惯等因素导致 CRC 的发生结直肠癌的发生很大程度上还受食物和营养因素的影响。据统计，30%～50%的结直癌患者有不当膳食结构和营养因素[17]。研究认为，高热量、高饱和脂肪酸和高胆固醇膳，以及食用富含亚硝胺的食品可能与结直肠癌的发生有关，而高膳食纤维、高维生素、叶酸膳食可能是结直肠癌的保护因素[18]。除了饮食，以下风险因素（其中经常共同发生交互）已经被识别和建立在流行病学上的研究：家族史的结肠直肠癌，炎症性肠病，吸，过度饮酒，肥胖和糖尿病（表 2）[19]。表 2 结直肠癌的风险与预防因素的概述[19]因素 风险社会人口因素年龄 ↑↑↑

图 2.2 5-FU 对 HT-29 细胞生长的抑制作用（48 h）同浓度下的冻干粉溶液对 HT-29 细胞的影响10株菌同时进行筛选，采用从高浓度到低浓度的冻干粉溶液对 HT-29细胞生长曲线。本实验的使用浓度依次为 250 mg/ mL、125 mg/ mL、10 mg/ mL、5L，在 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h 处测定 OD 值，用 O
【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 宋美璇;李显蓉;;结直肠癌的发生与饮食构成因素关系的研究进展[J];中国普外基础与临床杂志;2015年09期

2 祁云霞;刘永斌;荣威恒;;转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J];遗传;2011年11期

3 李卫芬;文静;吴红照;翟玲;余东游;;枯草芽孢杆菌对肉鸡生长性能和肠黏膜抗氧化及免疫功能的影响[J];中国畜牧杂志;2011年09期

4 张纪伟;杜鹏;陈大伟;崔龙;应春妹;;补充双歧三联活菌对结直肠癌术后患者免疫状况和炎性反应的影响[J];中华胃肠外科杂志;2010年01期

5 唐三元;曹建国;刘华清;;发酵乳酸杆菌对人结肠癌裸鼠移植瘤生长及免疫功能的影响[J];实用医院临床杂志;2007年01期

6 孟利,张兰威;乳酸菌胞外多糖的生理功能及其在食品中的应用[J];现代食品科技;2005年04期

7 耿珊珊,蔡东联;短链脂肪酸对结肠肿瘤细胞增殖分化的影响[J];肠外与肠内营养;2005年05期

8 陈尔真,曹伟新,燕敏,费旭峰,陈雪华;丁酸对人结肠癌细胞株SW1116增殖及分化状态的影响[J];外科理论与实践;2003年03期

9 王立生,潘令嘉,陈村龙,李明松,孙勇,张亚历,周殿元;双歧杆菌对裸鼠移植大肠癌增殖与凋亡的原位研究[J];世界华人消化杂志;2000年04期

本文编号：2865646