iASPP调控膀胱癌耐药性的初步研究

发布时间：2020-11-01 13:25

　　 化疗耐受是影响肿瘤患者不良预后的重要原因之一,膀胱癌作为典型实体瘤,对多种化疗药物具有高耐受性。因此,深入理解膀胱癌化疗耐受的分子机制至关重要。肿瘤细胞凋亡调控通路异常是其抵御化疗药物诱导杀伤效应的重要手段之一。肿瘤细胞凋亡受多种因子调控,其中p53是影响肿瘤细胞凋亡调控重要调控因子,p53通过调控凋亡相关靶基因表达,进而影响肿瘤细胞凋亡。而p53在细胞内受多种调控因子影响。其中,iASPP是p53的重要抑制因子,iASPP能结合并抑制p53对下游抗氧化靶基因的转录激活,进而抑制肿瘤细胞凋亡,因此发挥原癌基因的作用。iASPP属于ASPPs蛋白家族,大量研究显示iASPP在多种肿瘤中高表达,并与肿瘤化疗耐受有关,但iASPP调控肿瘤化疗耐受的分子机制研究的不够深入。此外,iASPP在膀胱癌中表达水平与作用未知,有待发掘。本文通过实时荧光定量PCR、免疫组化和免疫印迹等实验手段,证实iASPP m RNA水平与蛋白水平在膀胱癌组织和细胞中均显著升高。随后本文检测细胞活力后发现膀胱癌细胞化疗耐受与iASPP有关。通过外源过表达和RNAi干扰技术,证实iASPP干扰后的细胞耐药性下降,iASPP过表达则细胞耐药性上升。本文进一步利用细胞流式分析和实时荧光定量PCR技术研究iASPP增强膀胱癌细胞耐药机制,结果发现,iASPP通过抑制ROS水平来发挥细胞凋亡抑制的作用,同时还发现iASPP抑制凋亡基因Bax m RNA表达,促进抗凋亡基因Bcl-2m RNA表达。进一步通过核质组分分离实验,发现iASPP主要定位于细胞质,且这些膀胱癌细胞中p53发生功能抑制性突变。本文为进一步明确iASPP调控膀胱癌细胞凋亡的分子机制,本文利用实时荧光定量PCR和免疫印迹等手段检测发现iASPP提高Nrf2蛋白水平及其下游抗氧化靶基因表达(FTH1、HMO1、NQO1),但对Nrf2 m RNA以及Keap1蛋白水平没有影响。综上,本研究证实iASPP在膀胱癌中高表达,并且可能以p53非依赖性方式,提高Nrf2蛋白水平,Nrf2抗氧化靶基因以及促凋亡Bax的表达,抑制凋亡抑制因子Bcl-2表达,抑制ROS水平,抑制细胞凋亡,进而增强膀胱癌细胞对多种化疗药物的耐受。本研究将为膀胱癌耐药机制研究提供新的思路。
【学位单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.14
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 课题来源及研究背景和意义
    1.2 国内外在该方向的研究现状及分析
        1.2.1 国内外研究现状
        1.2.2 国内外文献综述的简析
    1.3 主要研究内容
        1.3.1 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表达水平研究
        1.3.2 iASPP对膀胱癌细胞化疗耐药的影响
        1.3.3 iASPP调控膀胱癌耐药分子机制的研究
    1.4 技术路线图
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法和步骤
        2.2.1 载体构建
        2.2.2 质粒提取
        2.2.3 细胞的复苏
        2.2.4 细胞传代培养
        2.2.5 细胞冻存
        2.2.6 细胞瞬时转染
        2.2.7 免疫印迹实验
        2.2.8 实时荧光定量PCR
        2.2.9 MTT法测定细胞半致死率
        2.2.10 细胞核质分离实验
        2.2.11 细胞凋亡检测
        2.2.12 细胞活性氧水平检测
        2.2.13 免疫组化
第3章 膀胱癌中iASPP蛋白及mRNA表达水平研究
    3.1 膀胱癌组织中iASPP表达水平研究
        3.1.1 免疫组化检测iASPP蛋白水平
        3.1.2 组织免疫印迹检测iASPP蛋白水平
        3.1.3 组织实时荧光定量PCR检测iASPPmRNA水平
    3.2 膀胱癌细胞系中iASPP表达水平
        3.2.1 膀胱癌细胞中iASPPmRNA表达水平
        3.2.2 膀胱癌细胞中iASPP蛋白表达水平
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
第4章 iASPP对膀胱癌细胞化疗耐药的影响
    4.1 膀胱癌细胞化疗药物的耐受性
    4.2 内源iASPP对膀胱癌细胞化疗药物耐受性的影响
        4.2.1 iASPP过表达载体的构建
        4.2.2 内源iASPP蛋白对5637细胞化疗药物耐受性的影响
        4.2.3 内源iASPP蛋白对T24细胞化疗药物耐受性的影响
        4.2.4 外源过表达iASPP蛋白对T24细胞化疗药物耐受性的影响
    4.3 讨论
    4.4 本章小结
第5章 iASPP调控细胞耐药分子机制的初步研究
    5.1 iASPP通过抑制膀胱癌细胞ROS而抑制细胞凋亡
        5.1.1 iASPP蛋白下调与外源过表达效率验证
        5.1.2 内源iASPP对膀胱癌细胞凋亡水平的影响
        5.1.3 外源过表达iASPP对T24细胞凋亡水平的影响
        5.1.4 iASPP对膀胱癌细胞ROS水平的影响
        5.1.5 ROS对iASPP调控膀胱癌细胞凋亡的影响
    5.2 iASPP可能以p53非依赖方式抑制膀胱癌细胞凋亡
        5.2.1 膀胱癌T24、5637细胞p53基因均为突变型
        5.2.2 iASPP蛋白在细胞质中表达较多
    5.3 内源iASPP对膀胱癌细胞Nrf2及下游靶基因的影响
    5.4 外源过表达iASPP对T24细胞Nrf2及下游靶基因的影响
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
结论
展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果
致谢

【参考文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 罗楠;iASPP在慢性粒细胞白血病非BCR-ABL依赖型耐药机制的研究[D];哈尔滨工业大学;2016年

本文编号：2865597