E3泛素连接酶HRD1调控肿瘤发生发展的分子机制研究

发布时间：2020-11-01 07:29

　　 细胞内存在数千种蛋白质并构成一种精细网络,它们在细胞中的相互作用受到严格控制,这种控制网络的不平衡将导致各种遗传疾病以及癌症。癌症可以从癌蛋白的稳定化或者肿瘤抑制基因的不稳定化发展而来。同时癌细胞能维持较高量的蛋白水解机制,并促进肿瘤抑制蛋白的降解或原癌基因的激活。因此,泛素-蛋白酶体系统(UP-S)的研究对于肿瘤的治疗将具有重要的意义,并且可能存在大量的潜在靶标进行有针对性的干预治疗。HRD1,也被称为synoviolin,是一种内质网相关蛋白降解的E3泛素连接酶。HRD1可以识别、泛素化靶标蛋白参与内质网相关蛋白降解途径,清除内质网腔内的错误折叠蛋白,以维持内质网的蛋白稳态。同时研究表明HRD1不仅可以泛素化错误折叠的蛋白介导它们的降解,同样可以通过降解其它非折叠错误的蛋白进而参与到包括调控肿瘤发生发展等众多的细胞生物学过程中。因此,研究HRD1及其潜在的靶标蛋白对于了解肿瘤发生发展的分子机制及开发潜在的肿瘤治疗靶标具有重要的研究意义。本研究分为两个部分,第一部分探讨了HRD1作为PTEN的E3泛素连接酶并通过蛋白酶体途径的降解促进肝癌细胞增殖以及肝癌进展的分子机制的研究。第二部分主要探讨了E3泛素连接酶HRD1,通过泛素化介导的降解影响肺癌细胞中SIRT2稳定性,及HRD1-SIRT2相互作用对肺癌发生发展的影响。第一部分:HRD1介导的PTEN降解促进细胞增殖和肝癌进展PTEN是一种非常重要的抑癌基因,该基因的突变是许多癌症发展的一个步骤。我们通过蛋白质组学方法发现HRD1是肿瘤抑制因子PTEN的互作蛋白之一,且已有的研究表明HRD1在肝癌中表达上调,同时PTEN在肝癌中表达下调,本研究验证了HRD1与PTEN的相互作用,并进一步检测了HRD1-PTEN相互作用在肝癌的发生发展中的调节作用。主要研究结果如下:1.HRD1与PTEN相互作用并介导PTEN的泛素化及蛋白酶体途径降解首先通过外源及内源蛋白质-蛋白质相互作用分析验证了HRD1与PTEN之间存在相互作用关系;进一步检测出HRD1能够正向调节PTEN的泛素化水平,HRD1的过表达能特异性增加PTEN蛋白的泛素化水平;此外,CHX示踪实验显示,HRD1的过表达能显著缩短PTEN蛋白的半衰期,肝癌细胞中HRD1的敲低则增加了PTEN的半衰期,且蛋白酶体抑制剂MG132处理的HRD1敲低的肝癌细胞中PTEN的蛋白水平的回复,则表明HRD1能够通过泛素化介导的蛋白酶体途径降解PTEN。2.HRD1-PTEN相互作用在肝癌的发生发展中的调节作用我们筛选了稳定敲低PTEN,稳定敲低HRD1,以及稳定敲低PTEN后再敲低HRD1的肝癌Hep3B及MHCC97H的细胞株,同时筛选了高表达PTEN,高表达HRD1,以及高表达PTEN同时高表达HRD1的肝癌Hep3B及MHCC97H的细胞株。利用MTS及克隆形成实验检测了HRD1-PTEN对肝癌细胞增殖能力的影响,利用细胞划痕实验检测了HRD1-PTEN对肝癌细胞迁移能力的影响,以及利用Transwell实验检测了HRD1-PTEN对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果显示,HRD1通过调节PTEN进而促进肝癌细胞的增殖,迁移及侵袭能力。同时利用裸鼠成瘤动物模型检测了HRD1在体内对肝癌发生的影响,结果显示HRD1的缺失能够抑制肿瘤的生长。进一步在人肝癌样本中也显示出HRD1与PTEN表达模式的负相关性。因此HRD1介导PTEN泛素化对肝癌发生发展具有一定的调控作用。第二部分:E3泛素连接酶HRD1,通过泛素化介导的降解影响肺癌细胞中SIRT2稳定性已有的研究表明SIRT2与HRD1均在尤以帕金森病(PD)为代表的神经退行性疾病中发挥重要的作用。SIRT2的研究大部分都集中在其本身的去乙酰化的功能,其翻译后修饰的研究较少,同时越来越多的研究表明SIRT2同样是一种肿瘤抑制因子,且在多种癌症中下调,基因表达谱的分析也显示HRD1与SIRT2在肺癌中表达负相关。由此,我们推测SIRT2与HRD1应该也存在着相应的联系,且可能在肺癌的发生发展中起到一定的调节作用。本研究检测了HRD1与SIRT2的相互作用关系,并进一步分析了HRD1-SIRT2在肺癌发生发展中的作用。主要研究结果如下:1.HRD1作为SIRT2的E3泛素连接酶促进SIRT2的降解通过外源及内源蛋白质-蛋白质相互作用分析验证了HRD1与SIRT2的相互作用;并通过进一步的泛素化实验及CHX示踪实验表明HRD1能够作为SIRT2的E3泛素连接酶介导其泛素化及蛋白酶体途径的降解。2.HRD1-SIRT2相互作用在肺癌的发生发展中的调节作用我们筛选了稳定敲低SIRT2,稳定敲低HRD1,以及稳定敲低SIRT2后再敲低HRD1的肺癌A549及NCI-H446的细胞株,同时筛选了高表达SIRT2,高表达HRD1,以及高表达SIRT2同时高表达HRD1的肺癌A549及NCI-H446的细胞株。利用MTS及克隆形成实验检测了HRD1-SIRT2对肺癌细胞增殖能力的影响,利用细胞划痕实验检测了HRD1-SIRT2对肺癌细胞迁移能力的影响,以及利用Transwell实验检测了HRD1-SIRT2对肺癌细胞侵袭能力的影响。结果显示,HRD1通过调节SIRT2的蛋白水平进而促进肺癌细胞的增殖,迁移及侵袭能力。同时利用裸鼠成瘤动物模型检测了HRD1在体内对肺癌发生的影响,结果显示HRD1的缺失能够抑制肿瘤的生长,HRD1的异常表达则能够显著促进肿瘤的生长。进一步在人肺癌样本中也显示出HRD1与SIRT2表达模式的负相关性。3.药物处理对SIRT2蛋白水平的影响我们筛选了13种药物其中包括8种中药分别处理肺癌A549细胞,结果显示抗肿瘤药物依托泊苷的处理能增加SIRT2的蛋白表达水平,同时降低HRD1的蛋白表达水平。同时HRD1的敲低使肺癌细胞对凋亡敏感,而SIRT2敲低降低了肺癌细胞对细胞凋亡的敏感性。因此HRD1-SIRT2的相互作用研究为肺癌的发生发展提供一定的分子机制参考,及为肿瘤治疗提供可能的潜在靶标。
【学位单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.2
【部分图文】：

的泛素结合结构域（UBC）（分子量约 14-16 kDa）。即便在不同的泛素结合酶 E2中这种泛素结合结构域也有将近 35%的序列是相对保守的。泛素结合酶(E2)的主要作用是为泛素激活酶 E1s，泛素连接酶 E3s 和活化的 Ub 或 UBL 提供结合位点。UBL 是一种类泛素蛋白，如 SUMO，ISG15 和 NEDD8 等[25]，此类蛋白的功能是以类似于泛素化修饰的方式与目标蛋白，从而有效的调节靶蛋白的活性。E2s 能特异性的选择靶标蛋白上的赖氨酸位点并使之与泛素分子共价结合，并且泛素链的连接方式及长度也均由泛素结合酶 E2s 特异性的决定，进而调控靶蛋白的降解。早期的研究还表明即便没有泛素连接酶的 E3s 存在，泛素结合酶 E2s 也可以特异性的的催化靶标蛋白泛素链的形成。③ 泛素连接酶(E3)泛素连接酶 E3 的多样性及底物的多样性决定了泛素连接酶 E3 对底物的特异性选择。现在发现鉴定的泛素连接酶 E3 主要有四类：HECT，RING finger，U-bo以及 PHD 结构域的 E3 泛素连接酶[26-31]如图 1.2 所示。这 4 种形式的 E3 泛素连接酶中的每一种都是根据具有相似的催化机制进行分类，因此提供了独特的靶向机会。

Raymond J Deshaies（2014）图 1.3 26S 蛋白酶体的结构Figure 1.3. Structure of the 26S proteasome.由 4 个同轴的环组成，每个环由 7 个亚基组外侧的两个环称为 α 环，由 7 个 α 亚基组成由 7 个 β 亚基组成，其中 β、β2 和 βs 具有苏具有 Caspase 样肽酶活性，β2 具有胰蛋白酶[38, 40]。这些活性位点处于 20S 中心复合物内白质的降解。20S 核心复合物两端可与三种调节复合物结合即构成 26S 的蛋白酶体复合体体相结合。19S 调节复合物由 17 个不同亚基合物，另一个是盖复合物。前者由 6 个 ATP 酶由 9 个亚基组成。基底复合物中的 ATP 酶亚体降解腔通道的开启，具有降解底物去折叠

正如伊马替尼(imatinib)(GleeveceTM;GliveceTM)的病例中所ABL 融合癌蛋白的选择性抑制剂用于治疗慢性粒细胞白血病，BCR-A和过度扩增以及致病的依赖性丧失导致遗传畸变都可能发生，这些的治疗策略[55, 56]。对于 E3 泛素连接酶的抑制剂和泛素-蛋白酶体系统调节剂，不能排除类似的情况。事实上，最近有报道称，热休克蛋白 27使肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)(VelcadeTM)产生克蛋白 27 (Hsp27)的反义治疗则在抗性细胞中恢复了对药物的凋亡反体而言，特异性泛素-蛋白酶体系统(UP-S)抑制似乎是稳定肿瘤生长常有前景的途径。质网压力响应相关的蛋白质降解质网相关蛋白降解（ERAD）是一种细胞生物学过程，其靶向内质网白质，并泛素化错误折叠蛋白质随后被称为蛋白酶体的蛋白质降解8-60]。ERAD 主要包括三个步骤：识别内质网中错误折叠或突变的蛋从 ER 向细胞基质逆向转运和泛素依赖性的蛋白酶体降解(图 1.4)。
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本文编号：2865213