肿瘤相关成纤维细胞引起化疗耐药及天然化合物治疗食管鳞癌的作用机制研究

发布时间：2020-11-01 16:27

　　 全世界范围内,恶性肿瘤是常见疾病。其中食管癌的发病率在全部恶性肿瘤中排名第8位,死亡率排名第6位。食管癌根据组织类型可以分为食管鳞癌和食管腺癌,其中食管鳞癌在全球范围是最常见的食管癌组织类型,尤其在高发的东亚和非洲东南部,其中一些高危地区,包括中国,大约90%的病人是食管鳞癌。根据全球最新数据估计,每年全球范围内因食管癌死亡的病人为40.02万,其中我国为19.75万,占到全球总数的49.35%。目前食管癌死亡率在我国恶性肿瘤中排名第4位。尽管近年来我们对于食管癌的认识逐渐加深,从预防、诊断、治疗等各方面有了长足的进步,但是食管癌的总体情况是发现晚,治疗迟,预后差,五年生存率徘徊在15%至25%之间。对于食管鳞癌的治疗主要以内镜、手术、放化疗等为主,其中术前以及术后的辅助化疗是治疗食管鳞癌的重要手段之一。而化疗产生耐药是影响治疗效果和患者预后的主要问题所在。我们急需开发新的有效的药物来治疗食管鳞癌,同时对于目前临床常用的化疗药物如顺铂等产生耐药的机制需要进一步深入研究,以期克服耐药,改善预后,为患者最终带来获益。既往关于化疗耐药的研究集中于肿瘤细胞本身,其可能的机制包括肿瘤细胞的基因突变,细胞膜表面药物转运蛋白等的改变,细胞对药物代谢途径的改变等。而近年来的研究发现肿瘤微环境在肿瘤耐药中发挥了重要的作用,肿瘤微环境包括肿瘤相关成纤维细胞(CAF)、肿瘤相关巨噬细胞、血管内皮细胞、免疫细胞等,其中CAF是肿瘤微环境中的主要组成部分之一,它在肿瘤发生、发展、化疗耐药中发挥着关键作用,它可以被视为癌症治疗的潜在靶点。CAF主要通过细胞因子、细胞黏附以及影响免疫反应等对肿瘤微环境进行调节,从而影响肿瘤细胞。在本研究中我们首先从食管鳞癌病人的肿瘤组织中原代分离培养CAF,使用免疫荧光方法鉴定CAF特异的标记物。接下来我们使用共培养的方式发现顺铂预处理的CAF相比未处理的CAF可以促进食管鳞癌细胞的增殖和产生耐药。然后使用蛋白芯片,从顺铂预处理的CAF培养液上清中筛选出一种外分泌的细胞因子纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1),该细胞因子在CAF发生DNA损伤后分泌明显增加。当我们单独使用细胞因子PAI-1时,它可以通过旁分泌方式在体内外促进食管鳞癌细胞增殖并减弱顺铂对食管鳞癌细胞的杀伤作用。同时发现PAI-1可以通过激活AKT和ERK1/2信号通路,抑制caspase-3活性和ROS的增加来发挥作用。综上所述,我们研究发现CAF在食管鳞癌的发生、发展和化疗耐药中发挥了重要的作用。顺铂刺激CAF后可以分泌大量的PAI-1,其通过旁分泌作用促进食管鳞癌细胞的增殖、引起化疗耐药,它有可能成为食管癌鳞癌治疗的新靶点,使用PAI-1的抑制剂可以在体内实验与顺铂一起发挥协同作用,值得进一步地开发和研究。整个世界范围内,食管癌的发病率和死亡率在全部恶性肿瘤中分别排名第8位和第6位。食管癌常见病理类型分为鳞癌和腺癌,其中我国以食管鳞癌为主,占总病例的90%以上。早期食管鳞癌缺乏特异性症状,尽管近年来在诊断、治疗等各个方面有了长足的进步,但是仍然缺乏有效的针对食管鳞癌的治疗方法,目前主要的治疗手段仍然是内镜、手术、放化疗等,而食管鳞癌的总体生存率仍未有明显改善,徘徊在15%至25%之间。因此,我们急需发现有效的治疗食管鳞癌的药物。植物提取物是抗癌药物的重要来源之一,其中香茶菜属(Isodon)植物是著名的有生物活性的二萜类,它具有多种多样的骨架结构,尤其是对映-贝壳杉烷型二萜类。长管香茶菜甲素(LK-A)是一种从三叶香茶菜属中分离得到的对映-贝壳杉烷型二萜类化合物,关于它的抗癌作用已经在其他肿瘤中得到验证,包括鼻咽癌、肝细胞癌等。它可以通过引起肿瘤细胞DNA损伤、诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,引起细胞氧化应激水平升高等方式发挥抗癌作用。我们想要探讨的问题包括LK-A在食管鳞癌中是否具有同样的抗癌作用以及可能的机制,同时评估其未来的临床应用前景。经过前期筛选我们发现LK-A对食管鳞癌细胞具有显著抑制作用。我们通过CCK8实验发现LK-A可以明显抑制食管鳞癌细胞(KYSE30和KYSE450)增殖,同时对于非肿瘤正常细胞(NIH3T3和HEK293)的抑制作用明显减弱,其中在食管鳞癌中LK-A的24小时IC50值分别为1.259μM和1.370μM,而在非肿瘤正常细胞中的IC50值分别为3.941μM和5.744μM。随着LK-A剂量增加可以显著抑制食管鳞癌细胞平板克隆形成,引起食管鳞癌细胞G2/M期阻滞,降低细胞周期相关蛋白CyclinB1和cdc2表达水平。LK-A可以诱导食管鳞癌细胞凋亡,并呈时间、剂量依赖性,通过Westerm blot结果发现LK-A可能通过Caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导食管鳞癌细胞凋亡,同时使用Caspase抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK预处理可以部分减弱LK-A诱导的细胞凋亡。LK-A可以引起食管鳞癌细胞内活性氧簇(ROS)显著增加,使用抗氧化剂N-乙醜半胱氨酸(NAC)可以减弱LK-A诱导的细胞凋亡。LK-A可以激活JNK和p38 MAPK信号通路,使用JNK和p38 MAPK抑制剂可以减弱LK-A诱导的细胞凋亡,同时NAC也可以减弱JNK和p38 MAPK磷酸化水平。最后,体内裸鼠实验发现相比对照组,LK-A可以显著抑制裸鼠体内移植瘤的大小、体积、重量等,同时LK-A对裸鼠的一般情况、体重无明显影响,裸鼠肝肾组织的HE染色未见明显毒副作用。这些结果在体内证实LK-A是相对安全有效的抗癌药物。总之,我们的研究发现,LK-A可以在体内外抑制食管鳞癌细胞的增殖,促进其凋亡,可以在食管鳞癌细胞中发挥新的抗肿瘤作用,同时具有一定的安全性。这表明该化合物可能具有作为临床治疗药物的潜力,值得进一步研究。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.1
【部分图文】：

２、质粒的小量提取??本研究中使用天根生物科技有限公司提供的质粒小提中量试剂盒（ＴＩＡＮｐｒｅｐ??ＭｉｄｉＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ）。在使用前应先在漂洗液ＰＷ中加入无水乙醇，并在瓶身上做好标??记。具体操作步骤如下所示：??（１）柱平衡步骤：向吸附柱ＣＰ４（吸附柱放入收集管中）中加入５００Ｍ的平衡溶??液，在１２０００转／分（１３４００ｇ）的条件下离心１分钟，倒掉收集管中的废液，??将吸附柱重新放回到收集管中。??（２）取５ｍｌ过夜培养的菌液加入到离心管中，在１２０００转／分（１３４００ｇ）的条件下??离心１分钟，倒掉并尽量吸除上清液。??（３）向留有菌体沉淀的离心管中假如５００Ｍ的溶液Ｐ１，使用移液器或者漩涡振荡??器彻底悬浮细菌细胞的沉淀。??（４）向离心管中加入５００４的溶液Ｐ２，温和的上下翻转６－８次使菌体充分裂解。??（５）向离心管中加入７００Ｗ的溶液Ｐ３，立即温和的上下翻转６－８次，充分混匀，??此时会出现白色絮状沉淀，在１２０００转／分（１３４００ｇ）的条件下离心１０分钟，??此时在离心管底部形成沉淀，注意Ｐ３在加入之后应当立即混合，避免产生??

北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文?实验方?表３标准品蛋白浓度与ＯＤ?５６２ｎｍ值的关系??标准品编号?标准品浓度（路／ｍｌ）?ＯＤ?５６２ｎｍ值??Ａ?２０００?１．０３１５??Ｂ?１５００?０．８１３８??Ｃ?１０００?０．５８６９??Ｄ?７５０?０．４９２４??Ｅ?５００?０．３７９２??Ｆ?２５０?０．２５２９??Ｇ?１２５?０．１６４２??Ｈ?２５?０．１２６８??Ｊ?０?０．０９８１???－

北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文实验结果??一、食管鱗癌ＣＡＦ的分离、培养和鉴定??首先，如前所述［１４］，从食管鳞癌患者肿瘤组织中原代分们发现ＣＡＦ显示出与肿瘤细胞形态不同的纺锤样形态。我们使用ＣＡＦ特异标志物对ＣＡＦ进行了鉴定，包括用于区分成纤ａ－ＳＭＡ和ＥｐＣＡＭ。免疫荧光结果显示ＣＡＦ可以被ａ－ＳＭＡＥｐＣＡＭ抗体染色（图３Ａ和图３Ｂ?）这也证实了我们分离培养出
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本文编号：2865796