Claudin-6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用

发布时间：2020-11-01 21:19

　　 前列腺癌是前列腺上皮源性恶性肿瘤,转移和复发是晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。目前研究认为,肿瘤的生长和转移受多种因素调控,其中紧密连接(tight junction,TJ)与肿瘤细胞的增殖、运动以及侵袭等转移表型密切相关。紧密连接蛋白CLDNs作为紧密连接的主要构成成分,其表达异常能够影响紧密连接结构、功能以及相关的细胞信号传递,在上皮来源恶性肿瘤的发生和转移过程中起着重要作用。Claudin-6作为紧密连接蛋白CLDNs家族的成员之一,对维护细胞间紧密连接结构和功能起着重要作用。我们课题组的前期研究中,发现claudin-6能够明显抑制乳腺癌,宫颈癌,结肠癌细胞的迁移侵袭能力;推测claudin-6表达沉默可能在上皮来源的恶性肿瘤发生转移过程中发挥着作用。目前,关于前列腺癌细胞中claudin-6是否能够抑制前列腺癌细胞侵袭表型的研究尚未见报道。本文通过使用分子生物学技术,首次研究claudin-6对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,为前列腺癌治疗提供一定的理论支持。目的:探讨过表达claudin-6对前列腺癌细胞生物学表型的影响。方法:通过RT-PCR和Western Blot方法检测人前列腺癌细胞LNCAP和DU145中claudin-6基因和蛋白的表达状况;利用携带claudin-6的慢病毒转染前列腺癌细胞LNCAP和DU145,经过嘌呤霉素(puromycin;PM)筛选获得过表达claudin-6的稳定克隆;通过RT-PCR、Western Blot及细胞免疫荧光法鉴定慢病毒转染效率以及稳定细胞克隆中claudin-6蛋白的表达和定位;利用CCK-8试剂盒检测前列腺癌细胞的增殖能力并绘制细胞增殖曲线;流式细胞术检测过表达claudin-6后前列腺癌细胞周期的分布情况;通过跨上皮电阻实验检测前列腺癌细胞LNCAP和DU145的跨上皮电阻;通过倒置显微镜观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞形态的改变;通过鬼笔环肽荧光染色法观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞骨架的改变;细胞划痕实验、Transwell小室实验检测过表达claudin-6后前列腺癌细胞的迁移侵袭能力;Western Blot检测过表达claudin-6后,EMT相关蛋白的表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果显示,前列腺癌细胞LNCAP和DU145中claudin-6低表达;慢病毒转染后获得过表达claudin-6的稳定克隆LNCAP和DU145;RT-PCR和Western Blot结果显示,过表达claudin-6组的RNA以及蛋白水平表达均明显高于空载组;细胞免疫荧光染色实验结果显示,转染目的基因组中claudin-6均有表达,并且主要表达于细胞膜上,而空载组未见明显表达;CCK-8细胞活性实验结果显示,与空载组相比,过表达claudin-6组细胞的增殖能力均有下降;流式细胞仪检测细胞周期的结果显示,过表达claudin-6组细胞增殖活性与空载组相比均有减弱;通过跨上皮电阻实验结果显示,过表达claudin-6组单层细胞间跨上皮电阻明显高于空载组;倒置显微镜下观察发现过表达claudin-6后,前列腺癌细胞形态向上皮细胞形态转变,呈多角形,胞体扁平,界限不清;通过鬼笔环肽荧光染色法观察过表达claudin-6后前列腺癌细胞骨架Factin荧光强度减弱,胞质中微丝结构不明显;细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验的结果显示,转染目的基因组的迁移能力与空载组相比明显降低;Transwell细胞侵袭实验结果显示,过表达claudin-6组的侵袭能力与空载组相比明显降低;Western Blot结果显示,过表达claudin-6后上皮细胞标志物E-cadherin表达显著上调,而间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的表达明显下调。结论:过表达claudin-6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及逆转EMT,增加前列腺癌细胞的紧密连接功能。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

第三章 结果第三章 结果3.1 检测前列腺癌细胞系中 Claudin-6 表达水平采用 RT-PCR 技术和 Western-Blot 技术检测前列腺癌细胞系 LNCAP 和DU145 中 Claudin-6 的表达情况。实验结果显示，在前列腺癌细胞中，Claudin-6的 mRNA 水平和蛋白水平表达较低。如图 3.1 所示。

图 3.2 荧光显微镜下观察转染后的 293T 细胞293T/Vector 是转染空载质粒组，293T/Claudin-6 是转染目的质粒组病毒转染前列腺癌细胞 LNCAP 和 DU145后的 Cllaudin-6 慢病毒与促转染试剂 Polybrene 分别共转染前列腺CAP 和 DU145，传代扩增培养 15 天（加入嘌呤霉素筛选），荧光镜转导效率，分别采集荧光图像数据，如图 3.3 所示，LNCAP 细胞基因组转染阳性率达 95%以上，DU145 细胞空载组和目的基因组 80%以上。

图 3.3 荧光显微镜观察慢病毒转导的前列腺癌细胞A：慢病毒转染后的 LNCAP 细胞的空载组与目的基因组；B：慢病毒转染后的 DU145 细胞的空载组与目的基因组。.3 鉴定转染后前列腺癌细胞中 Claudin-6 的表达水平携带 Claudin-6 的慢病毒转染前列腺癌细胞 LNCAP 和 DU145，嘌呤霉选 15 天后，通过 RT-PCR 法和 Western-Blot 法鉴定 Claudin-6 的表达水显示，相较于空载组，目的基因组中 Claudin-6 的 mRNA 和蛋白表达水调（如图 3.4 所示， P<0.05）。表明成功建立了两株稳定表达 Claudin-6癌细胞系。
【参考文献】

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1 韩苏军;张思维;陈万青;李长岭;;中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J];临床肿瘤学杂志;2013年04期

本文编号：2866115