MicroRNA在慢性髓系白血病甲磺酸伊马替尼耐药中的作用及机制

发布时间：2020-11-03 02:23

　　 慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是由多能造血干细胞异常增殖所致的骨髓增殖性肿瘤,t(9;22)(q34;q11)易位产生的BCR-ABL1融合基因所编码的P210蛋白具有高度酪氨酸激酶活性,致使细胞增殖及凋亡异常。甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate,IM)作为第一个应用于临床的靶向治疗药物,为CML治疗开创了新的时代。但仍有一部分患者存在着原发或者继发性耐药,影响患者的预后及生活质量。MicroRNA(miRNA)是一类长约18-25个核苷酸的非编码小RNA,通过靶向作用于靶基因的3’非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR),在转录后水平抑制靶基因的表达,包括阻止靶基因的翻译及加速靶基因的降解。miRNA不仅参与了CML发生和发展,而且在IM耐药方面也发挥了重要作用。很多研究已经证实在IM治疗前后多种miRNA表达存在变化,同样在耐药的CML患者中也存在着miRNA的差异性表达,本研究通过高通量测序检测了mi RNA在CML的IM耐药及敏感的细胞株中的差异性表达,进一步选取了差异性较大的miR-202-5p作为研究对象,探讨其在CML细胞IM耐药中发挥的作用及机制。去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)可将泛素化的靶蛋白上的泛素解离下来,阻止蛋白质被降解,参与多种重要生命活动,包括细胞周期调控、基因转录、激酶活化、蛋白质降解、DNA修复等。泛素羧基末端水解酶15(Ubiquitin-specific proteases 15,USP15),是USP家族的成员,在不同的肿瘤中发挥不同的生物学作用。已有研究证实USP15参与了肿瘤对紫杉醇的耐药过程,但USP15在CML中的作用及调控IM耐药的机制尚不清楚,我们的实验证实miR-202-5p靶向抑制USP15的表达,通过miR-202-5p/USP15轴调控了CML对IM的耐药,为进一步研究CML的IM耐药及临床克服CML耐药提供实验基础。第一部分miR-202-5p在不同CML细胞株及CML患者中的表达差异目的:筛选CML耐药细胞株中差异性表达miRNA及验证mi R-202-5p在CML患者及不同细胞株中表达差异。方法:1.CCK-8方法检测K562/K562G细胞对IM的IC_(50);RT-q PCR检测K562/K562G细胞耐药基因的表达;Western blot检测K562/K562G的P-糖蛋白(P-gp)表达。2.高通量测序检测K562细胞及K562G细胞中miRNA表达差异。3.实时定量PCR(RT-qPCR)及原位杂交(FISH)方法检测mi R-202-5p在CML细胞中的表达。4.RT-qPCR及FISH方法检测miR-202-5p在CML患者中的表达。结果:1.K562G细胞株为IM耐药细胞株应用CCK-8方法检测了K562/K562G细胞对IM的IC_(50),在K562G细胞中IM的IC_(50)约为K562细胞的30倍;RT-qPCR方法证明K562G细胞中ABCB1基因表达水平高于K562细胞;Western blot证实在K562G细胞中,P-gp蛋白表达水平明显上调。表明K562G细胞为IM耐药细胞株。2.高通量测序检测miRNA在K562细胞与K562G细胞中的表达差异高通量测序结果显示,与K562细胞相比,在K562G细胞中有102种已知的miRNA表达上调,92种miRNA表达下调;差异性表达的miRNA的靶基因在多条信号通路上存在富集。3.mi R-202-5p在IM耐药的CML细胞株中表达增高RT-qPCR方法及FISH结果显示,miR-202-5p在耐药细胞株K562G中的表达量最高,在正常外周血白细胞中表达最低。4.mi R-202-5p在ABCB1(+)CML患者中的表达上调RT-qPCR及FISH结果显示ABCB1(+)CML患者的miR-202-5p的表达高于ABCB1(-)CML患者,并且CML患者中miR-202-5p的表达高于健康供者的miR-202-5p的表达。小结:miR-202-5p在CML耐药细胞株及ABCB1(+)CML患者中表达增加。第二部分miR-202-5p调控CML细胞对甲磺酸伊马替尼的敏感性目的:验证miR-202-5p是否直接参与了CML细胞对IM的耐药。方法:1.RT-qPCR方法检测不同浓度IM刺激后miRNA-202-5p的表达。2.K562/K562G细胞过表达或敲低miR-202-5p,CCK-8检测细胞对IM对IC_(50),AnnexinV/PI流式凋亡检测IM刺激后的细胞凋亡,Western blot检测Cyclin D1和Caspase-3的表达。结果:1.IM可下调CML细胞株miR-202-5p表达在K562/K562G细胞中,IM可降低miR-202-5p表达。2.过表达miR-202-5p可降低K562细胞对IM的敏感性与对照组相比,K562细胞过表达miR-202-5p后,IM的IC_(50)上升;给与IM刺激后,过表达miR-202-5p的K562细胞凋亡率下降。Western blot显示,过表达mi R-202-5p能够逆转由IM应用所带来对Cyclin D1的下降及Caspase-3的增加。3.敲低miR-202-5p可增加K562G细胞对IM敏感性与对照组相比,K562G细胞敲低miR-202-5p后,IM的IC_(50)下降;给与IM刺激后,敲低miR-202-5p的K562G细胞凋亡率增加。Western blot显示,敲低miR-202-5p能够增加由IM应用所带来的Cyclin D1的下降及Caspase-3的增加。小结:miR-202-5p调控CML细胞对IM耐药。第三部分mi R-202-5p靶向抑制去泛素化酶USP15表达调节CML细胞对甲磺酸伊马替尼的敏感性目的:证实mi R-202-5p靶向抑制USP15调控CML细胞株对IM耐药性的作用机制。方法:1.生物信息学预测miR-202-5p靶基因,RT-qPCR、双荧光素酶报基因,Western blot检测USP15为miR-202-5p的靶基因。2.RT-qPCR,Western blot及免疫荧光染色方法检测了CML患者中USP15的表达水平以及IM对USP15表达的影响。3.CML细胞过表达或敲低USP15,或同时过表达或敲低上述两者,然后CCK-8检测细胞IM的IC_(50);AnnexinV/PI流式凋亡检测IM刺激后的细胞凋亡;Western blot检测Cyclin D1、Caspase-3及USP15的表达。结果:1.在CML细胞中USP15是mi R-202-5p的靶基因与转染mimic-NEG组相比,K562细胞中过表达miR-202-5p下调USP15的mRNA表达水平。双荧光素酶报告基因测试显示mi R-202-5p mimic能靶向USP15的3'UTR序列。Western blot结果显示,转染miR-202-5p模拟物下调USP15蛋白的表达水平,而miR-202-5p抑制物提高USP15蛋白的表达水平。说明USP15是miR-202-5p的靶基因。2.USP15在K562G细胞中表达下降与K562细胞相比,USP15的mRNA及蛋白质表达水平在K562G细胞中显著下降,免疫荧光染色得到相同的结果,而且USP15主要定位在细胞质中。3.USP15在CML患者中低表达,且ABCB1(+)CML患者中的表达更低RT-qPCR及Western blot结果显示,与正常供者PBMCs相比,USP15的mRNA及蛋白质表达水平在CML患者PBMCs表达是明显下降的;免疫荧光染色得到相同的结果;而且在ABCB1(+)CML患者PBMCs表达更低。4.敲低USP15降低,增加K 562细胞对IM的敏感性CCK-8结果显示,与对照组相比,敲低USP15后K562细胞对IM的IC_(50)上升;而IM处理上述细胞后,Western blot结果显示,敲低USP15能够逆转由IM应用所带来的Cyclin D1的下降及Caspase-3的增加。5.过表达USP15可增加K562G细胞对IM的敏感性CCK-8结果显示,与对照组相比,过表达USP15后K562G细胞IM的IC_(50)上升;而IM处理上述细胞后,Western blot结果显示,过表达USP15能够增加由IM应用所带来对Cyclin D1的下降及Caspase-3的增加。6.mi R-202-5p/USP15轴调控CML细胞对IM的耐药K562细胞中共转染miR-202-5p mimic和pcDNA3.1-USP15,Western blot结果显示USP15蛋白表达增加,过表达USP15消除miR-202-5p对K562细胞的耐药性。在K562G共转染miR-202-5p inhibitor与si-USP15,Western blot结果显示USP15蛋白表达下降。用CCK-8方法检测共转染细胞与单转染miR-202-5p inhibitor细胞对IM的IC_(50),共转染组IC_(50)下降。这些结果表明USP15介导miR-202-5p对CML细胞IM耐药。小结:mi R-202-5p靶向抑制USP15表达调节CML细胞株对IM耐药。第四部分桑黄素通过调控miR-188-5p/PTEN轴诱导CML细胞凋亡及增加CML细胞对甲磺酸伊马替尼的敏感性目的:证实桑黄素是否过通过miR-188-5p/PTEN轴诱导CML细胞凋亡及增加CML细胞对IM的敏感性。方法:1 CCK-8方法检测桑黄素或与IM联合用药处理后细胞的增殖,AnnexinV/PI流式凋亡检测细胞凋亡率。2桑黄素处理细胞,RT-qPCR检测PTEN基因表达,Western blot检测PTEN蛋白及下游通路蛋白表达。3生物信息学预测可与PTEN基因靶向作用的miRNA,RT-qPCR检测桑黄素处理后miR-188-5p表达;双荧光素酶报告基因、Western blot检测PTEN是否是mi R-188-5p的靶基因。结果:1.桑黄素能够抑制CML细胞增殖,诱导CML细胞凋亡桑黄素抑制CML细胞株增殖,并诱导CML细胞凋亡,随着桑黄素浓度增大,细胞凋亡明显增多。2.桑黄素可以增加CML细胞对IM敏感性CCK-8检测结果显示,与对照组相比,桑黄素与IM联合用药可降低IM的IC_(50),且联合用药可明显增加细胞的凋亡率。3.桑黄素通过增加PTEN蛋白表达,抑制PI3K/AKT通路激活,促进细胞凋亡RT-qPCR结果显示,桑黄素处理CML细胞,PTEN的mRNA水平稍有增加;Western blot方法检测PTEN蛋白质表达增高,p-AKT蛋白质表达下降,Caspase-3蛋白质表达增加,BAX在蛋白水平和mRNA水平增加,BCL-2的蛋白水平和mRNA水平均明显下降。4.桑黄素可降低CML细胞中mi R-188-5p表达,从而上调PTEN的表达生物信息学预测miR-188-5p可靶向作用PTEN基因;RT-qPCR结果显示,桑黄素处理后miR-188-5p表达明显下降;荧光报告基因显示,转染miR-188-5p模拟物后,包含有PTEN野生型3'UTR组的荧光活性减少了33%;Western blot显示,在转染miR-188-5p模拟物,PTEN蛋白质的表达量下降,而miR-188-5p抑制物处理组,PTEN蛋白质的表达上升。桑黄素处理K562细胞后又同时转染miR-188-5p模拟物,发现与单加桑黄素相比,转染miR-188-5p模拟物后可明显逆转桑黄素增加的PTEN表达量。以上结果提示,在K562细胞中mi R-188-5p直接靶向PTEN 3'UTR抑制其蛋白质的表达。5.桑黄素通过抑制miR-188-5p表达诱导CML细胞凋亡,增加CML细胞对IM的敏感性CCK-8检测结果显示,敲低miR-188-5p组,IM的IC_(50)下降;转染miR-188-5p抑制物组与对照组相比,凋亡率明显增高;CCK-8方法检测细胞增殖率及IM的IC_(50),结果显示,通过转染miR-188-5p模拟物,可以逆转桑黄素与IM协同作用。以上结果说明桑黄素增能增加CML细胞敏感性是通过抑制miR-188-5p表达实现的。小结:桑黄素通过调控miR-188-5p/PTEN轴诱导CML细胞凋亡及增加CML细胞对IM的敏感性。结论:1.mi R-202-5p在CML耐药细胞株及ABCB1(+)CML患者中表达上调。2.miR-202-5p调控CML细胞对IM耐药3.miR-202-5p靶向抑制USP15表达调节CML细胞株对IM耐药4.桑黄素通过调控miR-188-5p/PTEN轴诱导CML细胞凋亡及增加CML细胞对IM的敏感性
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R733.72
【部分图文】：

图3 miR-202-5p在甲磺酸伊马替尼耐药的CML细胞株中表达增高Fig. 3 miR-202-5p is upregulated in imatinib resistance CML cell line. (A)Comparison of miRNA expression in K562 cells and K562G cells i by usingthe high-thoughput sequencing. The heatmap represents the miRNA with : 1.Log2（Fold-Change）≥2 or≤-2；2. P value≤0.05；3. count≥100. (B)RT-qPCR detected the expression of miR-202-5p in K562 cells and K562Gcells. The relative levels were normalized to U6 . (P < 0.001) (C) RT-qPCRdetected the expression of miR-202-5p in CML cell line and normal personPBMCs. Expressions of miR-202-5p in normal person PBMCs were lowercompared to CML cell line. (P<0.001) (D) Fluorescence in situ hybridization(FISH) staining was performed on sections from K562 cells , K562G cells andnormal person PBMCs. Red and blue staining indicates miR-202-5p, andDAPI. Bar = 40 μm.

图 2 过表达 miR-202-5p 可降低 K562 细胞对 IM 的敏感性Fig. 2 Upregulation of miR-202-5p decreases the sensitive of IM in K562 cells.(A). qRT-PCR was performed to measure miR-202-5p levels in K562 cellstransfected with the mimic-NEG or miR-202-5p mimic. Increased miR-202-5plevels were observed in the miR-202-5p transfected cells compared to themimic-NEG (P<0.001). (B) K562 cells were treated with IM (0.1μM) for 48 h.Cell viability was determined using a CCK8 assay. More cells survived inmiR-202-5p mimic transfected group. Upregulation of miR-202-5p increasedIC50 values of K562 cells to IM. (C) K562 cells were treated with IM（0.1μM）followed by analysis of apoptosis. There were fewer cells undergoingapoptosis in the miR-202-5p mimic transfected group. (D) Western blotting

图 3 敲低 miR-202-5p 可增加 K562G 细胞对甲磺酸伊马替尼的敏感Fig. 3 Knockdown of miR-202-5p promotes sensitive of IM in K562G (A) RT-qPCR was performed to measure miR-202-5p levels in K562Gtransfected with the inhibitor-NEG or miR-202-5p inhibitor. DecremiR-202-5p levels were observed in the miR-202-5p inhibitor transfectedcompared to the inhibitor-NEG.( B) K562G cells were treated with IM (3for 48 h. Cell viability was determined using a CCK8 assay. Less survived in miR-202-5p mimic transfected group. Knockdown of miR-20decreased IC50 values of K562G cells to IM. (C) K562G cells were trwith IM（3μM）followed by analysis of apoptosis. There were more undergoing apoptosis in the miR-202-5p inhibitor transfected group (P<0(D) Western blotting for Caspas-3 and CyclinD1 in K562G cells transfwith miR-202-5p inhibitor or inhibitor-NEG and treated with IM (3μM
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Amit K.Tiwari;Hsiang-Chun Wu;;Overexpression of P-glycoprotein induces acquired resistance to imatinib in chronic myelogenous leukemia cells[J];癌症;2012年02期

本文编号：2867955