乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,近年来,其发病率一直呈现不断上升的趋势。尽管目前针对乳腺癌的诊疗手段有了实质性的进展,然而由乳腺癌转移导致的死亡仍然是乳腺癌患者的主要死因,也使得乳腺癌的死亡率一直位于女性肿瘤死亡率的前列,因此,深入了解乳腺癌的转移机制,寻找乳腺癌转移过程中潜在的分子标志物,为乳腺癌的诊断和治疗提供更多的靶点是目前亟需解决的问题。MicroRNA作为一类高度保守的非编码单链小RNA,自发现起己被证实在多个物种中发挥重要作用,通过转录后调控参与并影响几乎所有的生理和病理进程。已有大量研究报道证实不少microRNA在乳腺癌侵袭转移的过程中发挥着促进或者抑制的调节功能。由于microRNA的数目繁多,新的microRNA还在不断地被发现,这些新发现的microRNA在乳腺癌转移过程中的调控机制目前尚不明确。因此,我们在本研究中将重点探索目前尚未被发现的、在乳腺癌转移过程中发挥重要调节功能的nicroRNA以及它们的作用机制。我们使用包含近1000个不同pri-miRNAs的microRNA Library慢病毒文库感染侵袭转移能力微弱的MCF-7细胞,然后通过Transwell的方法筛选出获得侵袭转移能力的细胞单克隆并进行测序,得到数十个可能促进MCF-7发生侵袭转移的microRNAs。经过体外Transwell实验验证后,我们选择对MCF-7侵袭转移促进效果最明显的miR-548家族成员之一——miR-548j作为我们后续的研究对象。通过体外及体内功能实验,我们证实miR-548j能够促进乳腺癌细胞的侵袭转移,同时并不影响乳腺癌细胞的增殖能力。然后,我们使用多个数据库软件进行分析预测,认为Tensinl可能为miR-548j的靶基因,并且通过体外及体内实验证实Tensinl为miR-548j的直接及功能性靶基因。接下来,我们通过对Tensinl的结构和功能进行分析,寻找其可能参与的信号通路。在对这些通路上的关键分子进行逐一检测后,我们确定niR-548j抑制T ensin1的表达并激活Cdc42,从而促进乳腺癌细胞的侵袭转移,并且我们分别使用Cdc42 siRNA和活性抑制剂验证miR-548j抑制Tensin1并促进乳腺癌细胞的侵袭转移需要激活Cdc42。随后,我们对60例新鲜冰冻乳腺癌组织以及其配对的癌旁组织进行了qRT-PCR和、Western blot检测,发现miR-548j在转移性乳腺癌组织中的表达水平明显高于非转移性乳腺癌(p=0.022),而Tensin1的表达则与miR-548j相反,在转移性乳腺癌组织中低表达(p=0.03)。然后我们对这两者以及Cdc42的表达水平在组织标本中的相关性进行了检测分析,发现miR-548j与Tensin1的表达呈现负相关,与Cdc42的表达呈现正相关,而Tensin1则与Cdc42的表达呈现负相关。本研究首次发现miR-548家族在乳腺癌细胞的侵袭转移中发挥了重要的作用,并且证实其家族成员——miR-548j能够促进乳腺癌细胞的侵袭转移。随后,我们对miR-548j在乳腺癌转移中的作用机制进行了深入研究,找到其功能性靶基因以及所影响的信号通路。同时,我们也对miR-548j与临床乳腺癌转移性之间的关系进行了检测分析,为深入了解乳腺癌的转移机制找到一个新的方向,并且为临床乳腺癌的诊疗找到一个新的潜在靶点。肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程：肿瘤细胞脱离原发灶组织进入循环系统,沿循环系统到达靶器官,最终形成远端转移。在这个过程中,上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)被认为是整个肿瘤转移的起始步骤,肿瘤细胞发生EMT脱离原发灶组织,获得运动能力,然后通过EMT的可逆过程——间质-上皮转化(Mesenchymal-Epithelial Transition, MET)在靶器官定植并形成远端转移灶。MicroRNA作为一大类通过转录后调控的方式参与肿瘤转移过程的分子,已经被证实在EMT过程中发挥重要的调节作用。许多研究报道己经发现不少microRNAs通过促进或者抑制肿瘤细胞发生EMT,最终影响整个肿瘤转移的过程。然而,作为在肿瘤转移中和EMT同等重要的MET,有关microRNA对MET的调控目前却鲜有报道。因此,我们在本研究中将重点研究microRNA在MET和肿瘤远端转移过程中的功能和作用机制。作为EMT的可逆过程,发生MET的肿瘤细胞中基因和microRNA的表达正好与EMT相反,因此,我们通过一个EMT的模型来寻找可能在MET过程中发挥作用的基因和microRNA。首先,我们在MCF-10A中过表达EMT的关键转录因子——SNAI1,使MCF-10A发生EMT,然后通过microRNA芯片和cDNA芯片分别找出在这个过程中发生改变的microRN A和基因,并通过生物信息学的方法分析预测它们之间可能存在的miRNA-mRNA调节网络。然后,我们选取了出现在调节网络中的六个microRNAs(miR-498、miR-935、miR-200c、miR-203、miR-182和miR-378)进行了qRT-PCR的验证,并最终确定将miR-182作为我们后续研究的目标。我们首先通过ChIP和Luciferase reporter实验证实SNAI1对miR-182存在直接调控作用,然后我们通过体外实验证实miR-182使乳腺癌细胞保持上皮样状态,并且能够部分逆转SNAI1所诱导的EMT过程。随后,我们发现在小鼠体内,miR-182在肺转移结节中的表达水平高于原位肿瘤,并且我们也通过动物实验证实miR-182能够促进乳腺癌细胞在远端器官的克隆形成能力和转移。接下来,我们通过数据库分析预测出miR-182潜在的下游靶基因,并且在实验中非常意外地发现SNAI1为miR-182的下游靶基因,通过实验我们找到了在SNAI1的3'UTR区上miR-182的结合位点。此外,我们用动物模型证实敲降SNAI1的乳腺癌细胞在经尾静脉注射至小鼠体内后转移至肺的能力明显增强。接下来,我们对40例新鲜冰冻乳腺癌以及配对癌旁组织标本进行了miR-182和SNAI1表达水平的检测分析,发现miR-182和SNAI1在乳腺癌组织中的表达呈现负相关。考虑到miR-182主要是在乳腺癌细胞克隆形成和远端转移过程中发挥作用,我们用ISH和IHC分别检测了另外36例转移性乳腺癌和配对转移阳性的淋巴结组织中miR-182和SNAI1的表达,发现与原位肿瘤相比,miR-182在转移阳性的淋巴结组织中表达增高,SNAI1的表达则与miR-182相反。本研究首次发现SNAI1在抑制miR-182表达的同时能够被miR-182负调节,这两者之间的负反馈环路可能在EMT和MET相互转换过程中发挥重要的调节作用,最终促进乳腺癌细胞在体内靶器官的克隆形成和远端转移。通过对临床组织标本的分析,我们发现SNAI1和miR-182的相互负调节作用在临床组织标本中同样存在。然而有关SNAI1-miR-182之间负反馈环路在整个肿瘤转移过程中的具体作用机制,以及所参与的信号通路还有待我们的进一步研究。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.9
【文章目录】：中英文缩略词
第一部分 miR-548j作用于Tensin1并通过激活Cdc42促进乳腺癌的侵袭转移
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
第二部分 SNAI1-miR-182负反馈环路调节EMT,从而促进乳腺癌细胞的克隆形成和远端转移
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
文献综述
参考文献
基金资助
致谢
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本文编号：
2867445
