LOXL2调控胆管癌细胞SNAIL的过程及机制研究

发布时间：2020-11-03 12:10

　　 背景:胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是威胁人类健康的重大疾病之一,发病率逐年升高,并且早期诊断困难,初次就诊患者手术率低于30%;胆管癌根治术后5年内生存率小于10%。目前,治疗胆管癌的方法不是太多,胆管癌患者的总体预后很差。胆管癌高发于40岁以上的人群,男性的发病率略高于女性,胆管癌威胁着人类的生命,给家庭、社会和国家造成很大的经济及精神负担。因此,寻找新的胆管癌治疗方法是目前面临的当务之急。侵袭转移是胆管癌致死的主要原因。上皮间叶样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促进胆管癌细胞侵袭转移能力的重要现象。而锌指转录因子(zinc-finger transcription factor,SNAIL)是介导EMT发生的重要因子,SNAIL通过沉默E-Cadherin进而直接或间接促进EMT的发生。赖氨酰氧化酶样蛋白-2(Lysyl oxidase–like2 protein,LOXL2)是EMT的关键调控因子。有关研究发现LOXL2参与了SNAIL的蛋白质翻译后修饰,并且这种修饰可能依赖于K98和K137位点,而SUMO是最近发现的调控数百种核蛋白。LOXL2调控Snail的过程和机制还不清楚,基于上述研究和我们前期实验结果,我们提出以下科学假设:在胆管癌细胞中,LOXL2可能通过介导苏素化正性调控SNAIL蛋白的表达,并且这种调控可能与SANIL的K98及K137位点有关。目的:在胆管癌细胞株RBE和QBC939中,研究LOXL2调控SNAIL的过程及机制,有望为预防和治疗胆管癌提供新的靶点,也为其他肿瘤的治疗提供新思路。方法:为了研究LOXL2调控SNAIL的过程及机制,我们在胆管癌细胞株RBE和QBC939中瞬时转染EX-LOXL2、EX-LOXL2-EX-SENP、EX-LOXL2-Si-SUMO、EX-LOXL2-MU等质粒,然后通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验验证LOXL2对SNAIL的调控作用,通过免疫荧光、蛋白免疫印迹和免疫共沉淀实验检测LOXL2、SNAIL和SUMO的结合情况,再通过蛋白免疫印迹实验检验LOXL2调控SNAIL的位点。结果:⑴在胆管癌细胞RBE和QBC939中,瞬时转染EX-LOXL2质粒,SNAIL蛋白的表达水平增高,(蛋白质免疫共沉淀发现:转染EX-LOXL2,SNAIL与SUMO结合)EX-LOXL2可能介导了SNAIL与SUMO结合。⑵在胆管癌细胞RBE和QBC939中,双瞬时转染EX-LOXL2和EX-SENP质粒,SNAIL表达水平下降。双瞬时转染EX-LOXL2和Si-SUMO质粒,SNAIL的表达水平同时下降。⑶在胆管癌细胞RBE中,双瞬时转染EX-LOXL2和K98/K137位点双突变质粒,SNAIL的表达水平下降。结论:在胆管癌细胞RBE和QBC939中,LOXL2通过介导苏素化正性调控SNAIL,并且此过程与SNAIL的K98和K137位点有关。实验结果为胆管癌的预防与治疗提供了新的靶点及理论基础。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.8
【部分图文】：

图 1.1 实验流程示意图Figure 1.1 Schematic diagram of the experimental process.4.1 质粒扩增实验我们以感受态与质粒 10：1 的比例把质粒导入到大肠杆菌 DH5α 中，经板、挑单克隆点摇菌和试剂盒提取扩增质粒（如图 1.2）。如图 1.3 是本实验XL2 质粒图谱。

LOXL2质粒图谱

5图 1.4 转染过程Figure 1.4 Transfection ProcedureO-IP 检测 LOXL2、SNAIL 和 SUMO 的结合情况疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）用于检测两种蛋白合，以此确定某种蛋白的新结合蛋白。优点是相互结合的蛋白是天译后修饰的。免疫共沉淀原理如图 1.5。
【参考文献】

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1 MEI Zhu;JIAO HuiKe;WANG Wei;LI Jie;CHEN GuoQiang;XU Ying;;Polycomb chromobox 4 enhances migration and pulmonary metastasis of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L[J];Science China(Life Sciences);2014年06期

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1 谢睿;NK4通过HIF-1α/VEGF途径对胆管癌微血管生成和侵袭的影响[D];南京医科大学;2017年

本文编号：2868551