负载Exosomes的树突状细胞联合PD-1抗体在小鼠肝癌治疗中的应用

发布时间：2020-11-05 04:26

　　 目前原发性肝癌的恶性程度较高,预后差,化学药物和放射治疗对该疾病的控制效果较差。因此当前对晚期肝癌缺少有效的治疗方案。索拉非尼虽然能够延长生存期,但仅延长约三个月的时间。近年来免疫治疗在原发性肝癌的治疗中起了一定作用,仍需要进一步提高疗效。在肿瘤免疫治疗中,肿瘤抗原在以树突状细胞(Dendritic cell,DC)为主的治疗中起着较为重要的作用。肿瘤细胞裂解物被DC摄取后使DC成熟并具备激活肿瘤特异性的T细胞的功能已在多种实体肿瘤中被证实。然而负载肿瘤细胞裂解物的DC使肝癌的获益并不显著。最近的研究显示肿瘤细胞来源的Exosomes(TEX)被认为一种免疫原性较强的肿瘤抗原,它能够被DC摄取,从而使DC成熟并且能够活化肿瘤特异性的T细胞使其对肿瘤细胞产生杀伤作用。在肿瘤抗原的持续刺激下,活化的CD8+T细胞表面表达一种抑制性受体(程序性死亡分子受体1,programmed death-1,PD-1),该受体与配体结合后使CD8+T细胞失去分泌细胞因子及增殖的能力,从而使活化的CD8+T细胞失去对肿瘤细胞的杀伤作用。研究显示PD-1是在抗原的刺激下诱导性产生,它的产生需要一定的时间。虽然肿瘤细胞来源的Exosomes作为肿瘤抗原在肝癌的治疗中疗效优于肿瘤细胞裂解物,但目前负载Exosomes的DC和PD-1抗体联合应用及应用的最佳时间组合在肝癌中尚未被报道。本研究进一步证实负载TEX的DC(DC-TEX)在肝癌中的抗肿瘤作用,同时也发现在给予DC-TEX后肿瘤组织内浸润的CD8+T细胞表达PD-1的情况,而在给予DC-TEX后不同的时间点给予PD-1抗体可产生不同的抗肿瘤作用。应用DC-TEX及PD-1抗体可增加索拉非尼在肝癌中的疗效。另外肝癌癌性腹水来源的Exosomes也可作为肿瘤抗原被DC摄取后进一步产生抗肿瘤作用。最后我们对比了晚期肝癌患者和健康对照者血清中的Exosomes水平,发现晚期肝癌患者血清Exosomes的水平明显升高。目的:1、进一步证实DC-TEX在肝癌中抗肿瘤作用,同时观察Exosomes作为肿瘤抗原是否能够诱导PD-1的表达。2、明确DC-TEX联合PD-1抗体在肝癌中能否产生协同抗肿瘤作用及两者应用的最佳时间和抗肿瘤的作用机制。3、DC-TEX联合PD-1抗体能否增加索拉非尼对肝癌的治疗作。4、晚期肝癌患者血清Exosomes的特异性蛋白是否可以作为肝癌特异性的肿瘤标记物。5、肝癌癌性腹水来源的Exosomes能否作为肿瘤抗原及其抗肿瘤的疗效和作用机制。方法:首先构建皮下瘤模型,应用Hepa1-6细胞构建皮下瘤模型,待皮下瘤的长径至1cm后,在无菌状态下将皮下瘤取出,并将其剪碎至1mm3,然后通过穿刺针将瘤块移植至小鼠肝左叶。并应用小动物MRI观察原位瘤的生长情况。原位诱发模型应用二乙基亚硝胺(DENA)腹腔一次性注射至15日龄C57小鼠。应用H22细胞系构建腹水瘤模型。应用流式细胞仪分析肿瘤组织中CD8+T细胞的变化,免疫组织化观察肿瘤组织中PDL-1的表达。ELISA检测外周血中细胞因子的变化。将DC与Exosomes共培养48小时,使DC摄取Exosomes并使其成熟。DC-TEX通过尾静脉注射,PD-1抗体采用腹腔注射的方式。CD4、CD8体内阻断抗体采用腹腔注射的方式,用于抗肿瘤机制的研究。晚期肝癌患者血清中的Exosomes应用试剂盒提取,并通过Western blot检测其特异性蛋白的表达。结果:1、DC-TEX能够对肝癌产生一定的抗肿瘤作用,但在产生抗肿瘤作用的同时,CD8+T细胞表面的PD-1的表达也增加,在给予DC-TEX后的72小时,CD8+PD-1+T细胞的数量达到峰值。2、在给予DC-TEX后不同的时间点给予PD-1抗体,所产生的抗肿瘤作用不同。在应用DC-TEX后72小时给予PD-1抗体所产生的抗肿瘤作用最佳。应用CD4、CD8抗体体内阻断及裸鼠荷瘤模型发现,DC-TEX及PD-1抗体的抗肿瘤作用主要通过CD8+T细胞起作用。3、DC-TEX联合PD-1抗体可以增加索拉非尼对肝癌的治疗作用。4、晚期肝癌患者血清中Exosomes的水平明显高于健康对照,且表达一些特异性的表面蛋白。5、肝癌癌性腹水来源的Exosomes也可作为肿瘤抗原,能够被DC摄取并且使DC成熟,且产生一定的抗肿瘤作用。结论:Hepa1-6细胞来源的Exosomes能够作为肿瘤抗原被DC摄取从而诱发抗肿瘤免疫反应。将DC-TEX与PD-1抗体联合应用可产生不同的抗肿瘤作用。DC-TEX联合PD-1抗体能够增加索拉非尼的对肝癌的治疗疗效。另外,晚期肝癌患者的血清Exosomes水平升高。肝癌癌性腹水来源的Exosomes也可作为肿瘤相关抗原。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

图１?Ｅｘｏｓｏｍｅｓ的特征

?北京协和医学院博士学位论文???细胞数量的变化及外周血中细胞因子的变化。应用ＤＣ－ＴＥＸ治疗后发现肿瘤组织中??的ＣＤ８＋Ｔ细胞的数量在７２小时前呈逐渐增加的趋势，而７２小时后变化不著（图Ａ）。??这表明ＤＣ－ＴＥＸ能够增加肿瘤组织中的ＣＤ８＋Ｔ细胞的数量，且其变化随着时间的变??化而存在一定的差异。另外ＤＣ－ＴＥＸ在体内活化Ｔ细胞的同时也会产生一些细胞因??子，如ＩＦＮ＿ｙ、ＩＬ－２和ＴＮＦ－ａ，这些细胞因子的产生也预示着体内免疫反应的诱??发（图Ｂ－Ｄ）。７２小时之后呈下降趋势但其变化不存在统计学差异。该现象也可以??为ＤＣ－ＴＥＸ每次治疗的间隔时间的确定提供一定的参考依据。??Ａ??

图３应用ＤＣ－ＴＥＸ作为抗原活化Ｔ细胞，不同时间点肿瘤组织中ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ细胞数量的变化。??Ａ结果显示，在应用ＤＣ－ＴＥＸ后，ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ细胞在０至７２小时呈逐渐増加的趋势，９６小时或??１２０小时与７２小时比较无显著性差异（ＺＭ３．０５）。ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ细胞在７２ｈ显著高于０、２４和４８??小时（ｎ＝６只／组，林＊代〇．?００１）。Ｂ应用小鼠的ＩｇＧ作为ＰＤ－１的同型对照，发现ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ??细胞的几乎没有表达，并且不同时间点其ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ细胞的变化无显著性差异（ｎ＝６只／组，??２２??
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本文编号：2871125