miR-381靶向调控MAP3K2表达对前列腺癌细胞的影响

发布时间：2020-11-12 04:22

　　 目的:探讨miR-381在前列腺癌细胞中的作用,寻找其靶基因,为治疗前列腺癌提供科学依据。方法:1.通过慢病毒转染建立稳定的PC-3、DU145细胞系,RT-PCR法检测miR-381表达水平,MTT实验、克隆形成和EdU实验检测细胞增殖能力,划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测细胞内相关蛋白(Cleaved-Caspase-3,Cleaved-Caspase-9,Bax,Bcl-2,MMP2,MMP9,E-cadherin,N-cadherin)的表达水平。2.前列腺癌细胞株PC-3等转染miR-381后,接种于裸鼠皮下;记录肿瘤体积大小,检测miR-381对成瘤能力的影响。3.利用生物学信息技术Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)对miR-381靶点进行预测,利用双荧光素酶报告基因法验证MAP3K2是否是miR-381的靶基因。4.qRT-PCR检测MAP3K2过表达效率。试验设置为四组:未转染组(Blank)、空载组(pcDNA 3.1-NC)、pcDNA 3.1-MAP3K2转染组(pcDNA 3.1-MAP3K2)、pcDNA 3.1-MAP3K2和miR-381 mimics共转组(pcDNA 3.1-MAP3K2+miR-381mimics)。同第一部分的试验方法,分析增殖和迁移侵袭相关数据。结果:1.荧光定量qRT-PCR提示,转染了miR381的PC-3和DU145细胞中miR-381表达水平显著高于对照组,表明转染成功;MTT实验、细胞克隆形成、EdU实验显示miR-381过表达组细胞增殖明显减弱,划痕及Transwell实验结果证实细胞迁移和侵袭水平也表现出下降趋势;流式细胞术实验表明miR-381高表达能够促进细胞凋亡。与Blank组相比,miR-381 mimics组细胞Cleaved-Caspase-3,Cleaved-Caspase-9,Bax和E-cadherin蛋白表达水平明显升高;相反的,Bcl-2,MMP-2,MMP-9和N-cadherin表达水平则显著降低。2.过量表达miR-381能显著抑制裸鼠移植瘤的生长,增加移植瘤中肿瘤细胞cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-3表达。3.Targetscan软件和双荧光素酶靶标实验表明MAP3K2是miR-381中的一个靶基因,MAP3K2在前列腺癌中的表达水平随着miR-381的升高反而降低。4.相对pcDNA 3.1-NC组,pcDNA 3.1-MAP3K2组展现出更高的增殖、抗凋亡和迁移侵袭能力。相对于pcDNA 3.1-MAP3K2组,pcDNA3.1-MAP3K2+miR-381 mimics组细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降,细胞凋亡水平提高。上述结果提示miR-381可能通过下调MAP3K2的表达抑制前列腺癌细胞的进展。结论:相对正常细胞,miR-381在前列腺癌细胞PC-3和DU145中低表达。过表达miR-381可显著降低其细胞的生存能力,包括增殖、抗凋亡、迁移、侵袭和EMT。而抑制miR-381可产生与之相反的作用。此外,体内试验跟细胞实验的结果一致:过量表达miR-381显著降低了裸鼠移植瘤的生长,并诱导了肿瘤细胞的凋亡。MAP3K2是miR-381的重要靶基因,miR-381可能通过下调MAP3K2基因的表达抑制前列腺癌细胞的发生发展。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

图 2-1 miR-381 在细胞 PC-3，DU145 和 RWPE-1 中的表达水平。**P< 0.01.2.3.2 RT-PCR 检测转染效率提取各组细胞总 RNA，qRT-PCR 检测细胞中 miR-381 的表达水平，如图 2-2所示，转染 miR-381 mimics 后，PC-3 和 DU145 细胞中 miR-381 表达量明显高于空载对照组和空白对照组。相反的，转染 miR-381 inhibitors 后，miR-381 表达水平明显降低。由此证明，转染实验是成功的。

MTT检测PC-3和DU145细胞生长情况

PC-3和DU145细胞克隆形成情况
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本文编号：2880241