目的:探究STAT3在ras癌基因诱导的肝肿瘤发生发展中的作用机制。方法:1.提取9月龄H-ras12V转基因雄鼠肝肿瘤组织(T)、肿瘤周围组织(P)以及9月龄非转基因雄鼠肝组织(Wt)样本,经病理确认后,提取总蛋白质和总RNA;提取人正常肝细胞株L-O2和人肝癌细胞株Hep3B的总蛋白质和总RNA;应用蛋白质印迹法检测组织和细胞样本中p-ERK、ERK、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、m TOR、p-STAT3、STAT3的蛋白水平;荧光定量PCR检测STAT3下游靶基因pik3r1在组织和细胞样本中的mRNA表达水平。2.用抑制剂LY294002、PD184352和Rapamycin(RAPA)分别抑制Hep3B细胞的PI3K/AKT、ERK和mTOR信号通路活性,在抑制后3,6和12 h提取总蛋白质,检测抑制剂对STAT3蛋白及其磷酸化水平的影响,在抑制后6,12和18 h提取总RNA,检测抑制剂对STAT3的下游靶基因pik3r1 mRNA水平的影响。结果:1.p-ERK的蛋白水平检测表明:T组织中的p-ERK蛋白水平为22.09±6.57,与Wt组织的0.08±0.02相比显著升高(t=5.80,P=0.004),与P组织的8.60±3.23相比也显著升高(t=3.19,P=0.033),P组织比Wt组织显著升高(t=4.57,P=0.045);细胞水平检测结果显示,人肝癌细胞系Hep3B中的p-ERK水平为人正常肝细胞系L-O2的10.87倍。ERK的蛋白水平检测表明:T组织中的ERK蛋白水平为16.39±3.40,与Wt组织的5.27±1.43相比显著升高(t=4.20,P=0.025),与P组织的4.76±1.79相比也显著升高(t=5.24,P=0.006);细胞水平检测结果显示,人肝癌细胞系hep3b中的erk水平为人正常肝细胞系l-o2的24.77倍。p-pi3k的蛋白水平检测结果表明:t组织中的p-pi3k蛋白水平为0.45±0.04,与wt组织的0.06±0.00相比显著升高(t=8.12,p=0.004),与p组织的0.23±0.04相比也显著升高(t=4.12,p=0.015),p组织比wt组织显著升高(t=3.32,p=0.045);细胞水平检测结果显示,p-pi3k水平在人正常肝细胞系l-o2和人肝癌细胞系hep3b中没有显著差异。pi3k的蛋白水平检测结果表明:t组织中的pi3k蛋白水平为0.87±0.13,与wt组织的0.03±0.00相比显著升高(t=10.56,p0.001),与p组织的0.28±0.09相比也显著升高(t=3.96,p=0.029),p组织比wt组织显著升高(t=3.43,p=0.019);细胞水平检测结果显示,人正常肝细胞系l-o2中的pi3k水平为人肝癌细胞系hep3b的500倍。p-akt的蛋白水平检测结果表明:t组织中的p-akt蛋白水平为0.69±0.04,与wt组织的0.10±0.02相比显著升高(t=22.90,p0.001),与p组织的0.08±0.03相比也显著升高(t=21.58,p0.001);细胞水平检测结果显示,人肝癌细胞系hep3b中的p-akt水平为人正常肝细胞系l-o2的6.77倍。akt的蛋白水平检测结果表明:t组织中的akt蛋白水平为0.19±0.04,与wt组织的0.08±0.05相比显著升高(t=2.96,p=0.041),p组织中的akt蛋白水平为0.25±0.04,与wt组织的相比也显著升高(t=4.38,p=0.012);细胞水平检测结果显示,人肝癌细胞系hep3b中的akt水平为人正常肝细胞系l-o2的6.75倍。p-mtor的蛋白水平检测结果表明:t组织中的p-mtor蛋白水平为0.44±0.02,与wt组织的0.14±0.03相比显著升高(t=14.36,p0.001),与p组织的0.16±0.04相比也显著升高(t=10.51,p0.001);细胞水平检测结果显示,人肝癌细胞系hep3b中的p-mtor水平为人正常肝细胞系l-o2的21.74倍。mtor的蛋白水平检测结果表明:mtor的表达水平在wt(0.18±0.06)、p(0.35±0.27)和t(0.61±0.67)之间没有显著差异;细胞水平检测结果显示,人正常肝细胞系l-o2中的mtor水平为人肝癌细胞系hep3b的5倍。p-stat3的蛋白水平检测结果表明:wt组织中的p-stat3蛋白水平为42.87±9.36,与t组织的4.27±0.72相比显著升高(t=4.119,p=0.015),p组织中的p-stat3蛋白水平为32.47±3.21,与t组织的相比也显著升高(t=8.73,p=0.001);细胞水平检测结果显示,人正常肝细胞系l-o2中的p-stat3水平为人肝癌细胞系hep3b的10倍。stat3的蛋白水平检测结果表明:wt(25.81±8.97)、p(27.81±0.61)和t(26.67±0.43)中STAT3的水平没有显著差异;细胞水平检测结果显示,人正常肝细胞系L-O2中的STAT3水平为人肝癌细胞系Hep3B的2倍。荧光定量PCR检测结果显示,与Wt相比,STAT3的靶基因pik3r1 mRNA水平在P、T中显著降低(P0.01);细胞水平检测结果显示,同L-O2相比,pik3r1 mRNA水平在Hep3B中显著降低(P0.001)。2.抑制实验结果显示:应用LY294002抑制剂后,与对照组相比,随着抑制时间的延长,p-AKT的水平逐渐降低,表明AKT的活化水平被有效抑制,与AKT的活化水平降低相反,p-STAT3水平明显升高;应用PD184352抑制剂后,与对照组相比,p-ERK水平几乎检测不到,表明ERK的活化水平被有效抑制,与ERK的活化水平降低相一致,p-STAT3水平也明显降低;应用RAPA抑制剂后,与对照组相比,在3 h,p-mTOR水平明显升高,与之相反,p-STAT3水平明显降低,在6 h,二者均没有显著变化,在12 h,p-mTOR水平明显降低,与之相反,p-STAT3水平明显升高。应用LY294002和PD184352抑制剂后,同正常对照组相比,pik3r1mRNA水平在6 h,12 h明显升高,在18 h又恢复到正常水平。应用RAPA抑制剂后,同正常对照组相比,pik3r1 mRNA水平在6 h没有明显变化,在12和18 h明显升高。结论:体内检测结果表明,在肝肿瘤发生发展的过程中,ras信号通路的激活直接诱导了p-STAT3及其下游靶基因pik3r1 mRNA水平的降低,提示STAT3可能具有抑制肝肿瘤发生发展的作用。体外检测结果也显示STAT3可能具有抑制人肝癌细胞株Hep3B的作用。抑制实验的结果表明,在Hep3B细胞中,ERK通路的活化能激活STAT3;而PI3K/AKT及mTOR通路对STAT3的活性可能起到抑制作用。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R735.7
【文章目录】：中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
1 材料
2 方法
结果
1.病理分析
2.ERK蛋白的表达水平及磷酸化水平的变化
3.PI3K蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
4.AKT蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
5.mTOR蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
6.STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
7.STAT3下游靶基因pik3r1 mRNA水平的变化
8.体外细胞系中ERK蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
9.体外细胞系中PI3K蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
10.体外细胞系中AKT蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
11.体外细胞系中mTOR蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
12.体外细胞系中STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平的变化
13.体外细胞系中pik3r1 mRNA水平的变化
14.PI3K、ERK、mTOR抑制剂对STAT3水平的影响
15.PI3K、ERK、mTOR抑制剂对pik3r1 mRNA水平的影响
讨论
结论
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间发表论文情况
致谢
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本文编号：
2879966
