VPS33B与NESG1相互作用调控miR-192-3p抑制肺腺癌增殖和转移

发布时间：2020-11-12 20:58

　　 研究背景和目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在所有恶性肿瘤中排在第一位。而肺腺癌是目前发病率最高的一类肺癌。癌基因与细胞生长密切相关,可促进细胞的增殖和转化。抑癌基因是一类存在于正常细胞内,可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因,抑制肿瘤细胞过度生长、增殖从而抑制肿瘤发生发展。癌基因和抑癌基因的调节失衡是肿瘤发生以及进展极其重要的原因。VPS33B是Sec1/Munc-18(SM)蛋白家族成员之一,其报道聚焦于关节挛缩、肾功能不全和胆汁淤积综合征(ARC syndrome)和巨核细胞与血小板α-颗粒的生物合成等疾病上。目前尚无VPS33B在肿瘤发病机制机理以及与肿瘤预后相关方面的报道。MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为22到25个核苷酸组成的非编码单链RNA,其密切参与到肿瘤的发生与发展。miR-192-3p在肿瘤中的功能和机制目前尚无任何报道。研究内容与方法1.VPS33B裸鼠肝包膜转移模型的建立利用裸鼠肝包膜转移模型验证VPS33B体内抑制肺腺癌细胞侵袭转移的能力。2.miR-192-3p抑制肺腺癌增殖及转移(1)利用miRNA芯片检测过表达VPS33B细胞株中miRNAs差异性表达;并用荧光定量PCR方法鉴定所选定miRNA在过表达VPS33B肺腺癌细胞中表达情况;(2)体外功能实验验证所选定的miR-192-3p对肺腺癌细胞增殖和转移的影响。3.预测并验证miR-192-3p的靶基因(1)用因特网上的生物信息学数据库预测miR-192-3p的直接靶基因;(2)蛋白免疫印迹(Western Blot)及实时荧光定量PCR检测mimics过表达以及用inhibitor干扰miR-192-3p的细胞中蛋白和mRNA水平的靶基因表达量的改变;(3)利用双荧光素酶报告(Luciferase Activity Report)实验验证确定miR-192-3p 靶基因;(4)体外细胞功能实验检测过表达其目的基因后miR-192-3p对肺腺癌细胞作用的影响。4.生物信息学数据库预测并实验证明p53启动子区所结合的转录因子(1)荧光定量PCR检测过质粒表达p53的肺腺癌细胞A549和H1975中miR-192-3p及其靶基因的表达量改变;(2)Western Blot验证p53对VPS33B所调控的信号通路影响;(3)在线生物信息学数据库和ChIP实验预测并验证p53启动子区所结合的转录因子;qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验检测上述转录因子对p53启动子活性影响。5.VPS33B与NESG1相互作用研究(1)用荧光定量PCR和Western Blot检测过表达VPS33B肺腺癌细胞中NESG1的表达情况;(2)利用显微共聚焦、免疫共沉淀等实验确认VPS33B与NESG1是否有相互作用;(3)利用在线数据库预测NESG1的启动子区域所结合的转录因子;(4)CHIP和EMSA实验验证上述预测的NESG1启动子区域转录因子结合位点是否有效;进一步用荧光素酶报告基因实验检测上述转录因子对NESG1启动子活性影响;验证NESG1对VPS33B所调控信号通路影响。结果1.肝包膜转移模型进一步验证VPS33B可在体内抑制肺腺癌细胞侵袭转移;2.miR-192-3p在过表达VPS33B肺腺癌细胞中表达上调,并可在体外发挥抑制肺腺癌细胞增殖和转移作用;3.CCNB1为miR-192-3p的直接靶基因,并受到其负性调控;过表达CCNB1可以逆转miR-192-3p对肺腺癌细胞增殖和转移的抑制作用;4.P53促进miR-192-3p表达,降低CCNB1表达,并抑制VPS33B调控的PI3K/AKT通路;c-Myc直接结合到p53的启动子区并抑制其转录;5.VPS33B与NESG1在肺腺癌细胞细胞质中存在共定位并相互作用,并且VPS33B通过抑制PI3K/AKT/c-Jun信号通路促进NESG1转录。结论VPS33B通过抑制PI3K/AKT/c-Jun信号通路,诱导NESG1表达,负性调控c-Myc,从而降低c-Myc与p53启动子结合,上调了 p53表达,因此转录了抑癌基因miR-192-3p表达,最后靶向CCNB1发挥了抑制肺腺癌细胞增殖和转移的作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

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【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 方志文;牟召霞;王新艳;翟玉栋;;p53与c-myc和cyclin B_1在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义[J];中华肿瘤防治杂志;2007年04期

相关硕士学位论文 前1条

1 刘艳;VPS33B抑制肺癌细胞增殖，迁移和侵袭[D];南方医科大学;2015年

本文编号：2881233