CRISPR-Cas9导向RNA对人抑癌基因p53与PTEN的编辑靶点筛选与效率验证
发布时间：2020-11-14 10:28
背景与目的:肿瘤一直以来都是威胁人类健康和缩短人类寿命的一类重要原因。近年来,随着临床医学的进步,越来越多的肿瘤治疗方法不断问世,每一种治疗方法在应用于临床之前都需要有大量的动物实验进行验证以确保其有效性及安全性。早期的动物肿瘤模型构建主要通过理化因素诱发,与人类肿瘤的发生和发展过程有较大差异。所以当下更多研究的是通过生物技术手段移植原代肿瘤细胞或诱导细胞内基因突变使实验动物患病的方法。本研究的探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统(CRISPR-Cas9)对人体内至关重要的2个抑癌基因p53与PTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研究工具。方法:通过序列分析确定p53及PTEN基因各亚型m RNA剪辑的共同外显子区域,针对该区域进行软件评分,设计选择针对p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9导向RNA(sgRNA)靶点各2个:p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。构建共表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR-Cas9质粒。选择处于对数生长期的293T细胞,将其分为对照组(未转染质粒的野生型293T细胞)和实验组(利用Lipo-fectamine2000转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP共表达质粒的293T细胞),流式细胞分选实验组绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞(成功转染质粒的细胞),2周扩增培养后提取基因组DNA,PCR扩增基因组DNA包含突变位点的区段,将扩增产物凝胶电泳后胶回收,连接至pEASY-Blunt Zero克隆载体中,转化,挑取单克隆菌斑培养,提取质粒DNA测序,对比对照组与实验组测序结果后确定RNA介导的特异基因位点突变效率。结果:转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒的实验组流式细胞术分选后GFP阳性率高达82%,与分选前(4%)比较明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。对分选培养后的细胞提取基因组PCR位点的扩增序列,比对实验组基因测序结果与未经sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒转染的对照组野生型细胞测序结果,p53-1、p53-2和PTEN-2诱导的突变效率分别为54.5%,45.5%和33.3%。结论:针对人p53及PTEN基因设计的sgRNA p53-1、p53-2和PTEN-2能够在基因组水平较高效率地成功介导Cas9进行位点特异性的基因编辑。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;R73
【部分图文】：
第2章 材料与方法2.3 实验流程模式图对实验整体设计思路及流程加以总结（图 2.1），将实验分为两大部分，上游sgRNA 靶点设计与克隆构建作为步骤 1（SgRNA 设计与质粒构建），下游细胞操作与基因编辑功能验证部分作为步骤 2（质粒转染与细胞分选及基因编辑效率分析）。
切割 pL-CRISPR.EFS.GFP 质粒使其线性化，该质粒的 sgRNA克隆位点两侧为一对 Esp3I 内切酶，该酶切割位点在其识别位点的下游因而成对使用时可以产生不易导致质粒自连的粘末端，通过合成 sgRNA 序列引物并褪火，我们可以获得具有同样粘性末端的 sgRNA 序列 DNA 双链并连接，挑取克隆测序选择正确插入 sgRNA 的 pL-CRISPR. EFS.GFP 质粒。随后利用lipo-fectamine2000将分别表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR质粒转染进 293T 细胞内，24-48 h 内通过荧光显微镜观察和流式细胞术分析均发现了 3%GFP 表达，证明质粒转染成功，并通过流式分选对表达 GFP 转染成功的细胞进行了纯化（图 3.2）。其中图 3.2 中 A，和 B 均为 1 次有代表性的实验结果图，而 C 为 3 次流式分析结果的统计图。如图可见，与分选前的荧光比率 4%相比，分选后荧光比率升高至 82%，P<0.05，成功富集了质粒转染成功的 293T 细胞。
图 3.3 PCR 产物电泳及测序结果A：p53 或 PTEN sgRNA-Cas9 质粒转染细胞对预期的突变发生区域扩增 PCR 产的电泳图。P53 靶向编辑质粒转染的细胞：M 列，marker; 1 列，p53 正常对组；2 列，转染 p53-1 sgRNA 质粒组；3 列，转染 p53-2 sgRNA 质粒组。P靶向编辑质粒转染的细胞：M 列，marker；1 列，转染 PTEN-2 sgRNA 质粒组列，转染 PTEN-1 sgRNA 质粒组；3 列，转染 PTEN-2 sgRNA 质粒对照组；4 转染 PTEN-1 sgRNA 质粒对照组。B：转染 PTEN-2 sgRNA 质粒的基因片段测序果。 C：转染 p53-1 sgRNA 质粒的基因片段测序结果。D：转染 p53-2 sgRNA粒的基因片段测序结果。Fig.3.3 PCR product electrophoresis and sequencing resultsA: The PCR product electrophoresis results of the expected genomic sequence ofp53/PTEN sgRNA-Cas9 plasmid transfected cells. The PCR amplification product
【参考文献】
本文编号：2883373
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;R73
【部分图文】：
第2章 材料与方法2.3 实验流程模式图对实验整体设计思路及流程加以总结（图 2.1），将实验分为两大部分，上游sgRNA 靶点设计与克隆构建作为步骤 1（SgRNA 设计与质粒构建），下游细胞操作与基因编辑功能验证部分作为步骤 2（质粒转染与细胞分选及基因编辑效率分析）。
切割 pL-CRISPR.EFS.GFP 质粒使其线性化，该质粒的 sgRNA克隆位点两侧为一对 Esp3I 内切酶，该酶切割位点在其识别位点的下游因而成对使用时可以产生不易导致质粒自连的粘末端，通过合成 sgRNA 序列引物并褪火，我们可以获得具有同样粘性末端的 sgRNA 序列 DNA 双链并连接，挑取克隆测序选择正确插入 sgRNA 的 pL-CRISPR. EFS.GFP 质粒。随后利用lipo-fectamine2000将分别表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR质粒转染进 293T 细胞内，24-48 h 内通过荧光显微镜观察和流式细胞术分析均发现了 3%GFP 表达，证明质粒转染成功，并通过流式分选对表达 GFP 转染成功的细胞进行了纯化（图 3.2）。其中图 3.2 中 A，和 B 均为 1 次有代表性的实验结果图，而 C 为 3 次流式分析结果的统计图。如图可见，与分选前的荧光比率 4%相比，分选后荧光比率升高至 82%，P<0.05，成功富集了质粒转染成功的 293T 细胞。
图 3.3 PCR 产物电泳及测序结果A：p53 或 PTEN sgRNA-Cas9 质粒转染细胞对预期的突变发生区域扩增 PCR 产的电泳图。P53 靶向编辑质粒转染的细胞：M 列，marker; 1 列，p53 正常对组；2 列，转染 p53-1 sgRNA 质粒组；3 列，转染 p53-2 sgRNA 质粒组。P靶向编辑质粒转染的细胞：M 列，marker；1 列，转染 PTEN-2 sgRNA 质粒组列，转染 PTEN-1 sgRNA 质粒组；3 列，转染 PTEN-2 sgRNA 质粒对照组；4 转染 PTEN-1 sgRNA 质粒对照组。B：转染 PTEN-2 sgRNA 质粒的基因片段测序果。 C：转染 p53-1 sgRNA 质粒的基因片段测序结果。D：转染 p53-2 sgRNA粒的基因片段测序结果。Fig.3.3 PCR product electrophoresis and sequencing resultsA: The PCR product electrophoresis results of the expected genomic sequence ofp53/PTEN sgRNA-Cas9 plasmid transfected cells. The PCR amplification product
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 Dongyuan Ma;Feng Liu;;Genome Editing and Its Applications in Model Organisms[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2015年06期
2 殷利眷;胡斯奇;郭斐;;CRISPR-Cas9基因编辑技术在病毒感染疾病治疗中的应用[J];遗传;2015年05期
本文编号：2883373
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