乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率逐年上升,手术切除肿瘤结合术后放化疗是乳腺癌主要的治疗方法,病理类型中以乳腺浸润性导管癌最常见,约占总80%左右[1]。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自发性乳腺癌(SBC)的发生与小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)感染有关,MMTV的扩增与激素调控有关。为了探索MMTVLTR在TA2小鼠基因组中的插入位点,利用反向PCR和嵌套PCR扩增TA2小鼠SBC中MMTV-LTRSAG基因两侧的不确定序列和TA2小鼠的正常乳腺组织。此外,在人类乳腺病理进行原位杂交,包括正常乳腺组织43例、乳腺囊性增生46例、乳腺导管内原位癌54例、原发性乳腺癌142例、淋巴结转移性乳腺癌47例。通过原位杂交的结果评价了插入位点的临床病理意义。我们确认MMTV-LTRSAG基因的插入站点位于TA2小鼠6号染色体上Igκv2-112与Igκv14-111之间。IGκC定位于TA2小鼠SBC和人乳腺癌组织的基质细胞中。RNA原位杂交的结果表明,肿瘤细胞呈IGκC阴性,基质细胞呈IGκC阳性。IGκC基质细胞的阳性染色指数最高的是淋巴结转移性乳腺癌,其次依次是原发性乳腺癌、乳腺导管内原位癌以及乳腺囊性增生。此外,IGκC阳性染色指数还与ER、HER2和Ki-67的表达相关[2]。我们的研究结果显示,在TA2小鼠中,基质中IGκC的表达与SBC的发生有关。IGκC可能是一个人类乳腺癌的发生和发展的高风险因素。我们确认了MMTV-LTRSAG基因的插入位点位于TA2小鼠的染色体6号染色体上Igκv2-112与Igκv14-111之间[4]。IGκC表达于TA2小鼠原发性乳腺癌与人类乳腺癌组织的基质细胞中。经RNA原位杂交,肿瘤细胞IGκC表达为阴性,而间质细胞中IGκC表达为阳性。其中淋巴结转移性乳腺癌表达最高,其次是乳腺原位癌,乳腺导管内原位癌,乳腺囊性增生。此外,IGκC阳性指数与ER,PR、HER2和ki-67的表达有关[5]。我们的研究结果表明,基质中IGκC的表达与TA2小鼠原发性乳腺癌的发生有关,揭示IGκC可能是人类乳腺癌发生和发展的高危因素。在序列分析结果的基础上,确定了MMTV-LTR位于TA2小鼠的6号染色体免疫球蛋白κv2-112(Igκv2-112)和Igκv14-111之间。IGκC RNA原位杂交显示TA2小鼠SBC和人类乳腺癌组织的基质细胞中IGκC表达为阳性。IGκC阳性染色指数与人类乳腺癌的发展程度相关,同时与ER,PR,HER2,Ki-67的表达有关。肿瘤浸润浆细胞被认定为IGκC的来源。本研究通过石蜡包埋组织(FFPE)经RNA原位杂交测定确认IGκC对于人乳腺癌的预后评估。天津医科大学建立了自发性乳腺癌(SBC)TA2小鼠模型,经过50多年对这个课题的研究,在这个模型中自发性乳腺癌(SBC)超过80%,SBC的发病率与妊妊娠次数有关以及与小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)感染有关。MMTV是一种逆转录病毒,其特征是长末端重复(LTRs)。MMTV类似于LTRs的序列包含激素响应的元素(HREs),转录增强因子-1(TEF-1),和一个超级抗原的开放阅读框(ORF)。Tientsin Albino 2(TA2)小鼠的自发性乳腺癌(SBC)的发生与小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)感染有关,MMTV扩增与激素调节有着密切的关联[3]。本文以探讨MMTV-LTR在TA2小鼠基因组中的插入部位为目的,利用反向PCR和巢式PCR扩增未知序列。MMTV-LTRSAG基因在自发性乳腺癌和TA2小鼠正常乳腺组织中均存在。在原病毒中存在的SAG基因的表达负责SAG的生产。MMTV启动子包含一个HRE,能与黄体酮、糖皮质激素受体和雄激素受体结合促进MMTV基因的表达。我们之前的研究证实了联合外源性雌二醇和孕酮治疗在缺失卵巢的TA2小鼠中诱发乳腺癌。作为一种逆转录病毒,MMTV可以将其基因组融合到TA2小鼠的基因组中。当病毒DNA被插入或甚至接近致癌基因时,它就能够改变该基因的表达,导致癌症的发展。MMTV在激素的刺激下尚未被激活,当激素与重复序列TGTTCT结合,在MMTV-LTR的HRE作用下,在TA2小鼠中SBC的发生率与妊娠频率以及MMTV感染有关。雌二醇和孕激素可与HRE结合,进而诱发乳腺癌。在TA2小鼠中,SBC的发生可能类似于人类妊娠相关乳腺癌(PABC)。PABC被定义为在怀孕期间或在怀孕第一年之后诊断的乳腺癌。PABC发展的机制包括青春期激素水平变化以及孕期激素水平变化。此外,我们之前的研究证明TA2小鼠SBC是三阴性乳腺癌,三阴性乳腺癌是浸润性乳腺癌重要的一个类型,肿瘤组织表达雌激素受体(ER),孕激素受体(PR)和HER2均为阴性。三阴性乳腺癌多发于年轻女性,其预后很差。目的:探讨免疫球蛋白IGκC在人类及TA2小鼠乳腺癌的发生发展过程中的作用。方法:本实验研究采用PCR,原位杂交,组织芯片和免疫组织化学方法,使用SPSS17.0统计分析软件探讨乳腺各种病变中IGκC基因表达的意义,进一步揭示IGκC基因在乳腺癌发生发展以及预后中的作用。我们收集南开大学附属天津市人民医院142例乳腺组织标本,包括乳腺导管内癌,浸润性癌,囊性增生,乳腺派杰氏病,以及乳腺微乳头癌,通过动物实验、PCR、组织芯片、免疫组化、RNA原位杂交的方法,阐明了IGκC基因与乳腺癌发生发展过程中的作用以及分子机制,为乳腺癌的治疗以及预后从新的角度提供更有效的分子治疗靶点,同时为乳腺癌病人的预后进行分子标记物方面的检测。结果:1.在不同病变的乳腺组织中IgK基因表达的程度不同。在142例病例中IgK基因在不同乳腺病变包括正常乳腺组织、不典型增生、导管内乳头状瘤、导管原位癌、浸润性乳腺癌和转移性乳腺癌,均有不同程度表达。2.从正常乳腺组织和乳腺癌中提取基因组和总RNA。总RNA被反向转录到cDNA。在MMTV3'LTR引物的基础上,进行PCR检测,正向PCR和反向PCR列表的序列的详细信息,序列长度为1090bp和1024bp。与NCBI-BLAST相比,前向PCR序列与MMTV不匹配。然而,正向PCR结果与小鼠基因组的序列相似性大于99%。与NCBI-BLAST相比,反向PCR序列是小鼠基因组的一部分。3.乳腺癌、增生乳腺组织和正常乳腺组织均为石蜡包埋,用于RNA原位杂交。IGκC RNA原位杂交结果显示,基质细胞是积极的。强烈的IGκC染色出现在乳腺癌的TA2,弱的染色IGκC存在于增生的乳腺组织,正常乳腺组织为阴性IGκC染色。细菌dapB探针的阴性对照证实了结果的可靠性。结论:1.在不同病变的乳腺组织中IgK基因表达的程度不同。2.IGκC基因的表达与乳腺不同病变相关,且IGκC基因RNA原位杂交的表达强度与人类乳腺癌的发展进程有关。3.乳腺不同病变与IgK基因表达密切相关,与诸多相关免疫分子密切相关。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：
cDNA中整合结果图
实验结果：（1）目的参照基因验证应用特异引物验证正常小鼠与乳腺癌小鼠中 MMTV3'LTR 基因片段在cDNA 以及基因组中是否存在，其实验结果如图 1、图 2 所示，与文献[1]的实验结果相同，目的参照基因在正常小鼠中不存在，在乳腺癌小鼠中存在，证明 MMTV 有序列插入小鼠基因组中，本实验方案可行；
目的参照基因在正常小鼠中不存在，在乳，证明 MMTV 有序列插入小鼠基因组中，本实验方案可cDNA 中整合结果图 图 2 基因组中整合TRSAG 在小鼠基因组中整合鉴定引物对 MMTV-LTRSAG 基因进行扩增，获得长度约为 130 3 所示，可以推断 MMTV-LTRSAG 基因整个片段整合到小
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本文编号：
2883451
