Pokemon对乳腺癌细胞ER、PR表达的影响及机制的初步研究

发布时间：2020-11-15 02:26

　　 目的:明确Pokemon对乳腺癌细胞(MCF7及T47D)ER、PR表达的影响,同时初步探讨相关分子机制,分析Pokemon与ER、PR在临床中的相关性。方法:本实验分为三部分,第一步,以体外培养的乳腺癌MCF7及T47D细胞为研究对象,设计Pokemon特异性siRNA,通过瞬时转染将siRNA转至MCF7及T47D细胞中,采用q-RTPCR及免疫印迹实验分析检测siRNA对Pokemon的沉默情况,构建沉默Pokemon的MCF7及T47D细胞。通过Western Blot方法了解Pokemon对ER、PR蛋白水平表达的影响,通过q-RTPCR检测分析ER、PR核酸转录表达情况;第二步,通过构建ER启动子序列,检测MCF7细胞中该启动子的表达活性。将ER启动子质粒及Pokemon siRNA瞬时共转至MCF7细胞中,应用双荧光素酶报告基因活性实验分析Pokemon对ER启动子活性的影响,从而探究Pokemon影响ER表达的机制;最后应用免疫组织化学方法检测100例非特殊型浸润性乳腺导管癌组织及10例边缘组织和50例不同病理类型的人乳腺癌组织及50例淋巴结转移癌组织中Pokemon及ER、PR的表达情况,分析三者在临床中的相关性。结果1.通过q-RTPCR和Western Blot检测证实Pokemon对乳腺癌细胞(MCF7及T47D)ER、PR的表达具有影响,沉默Pokemon可抑制ER、PR核酸转录及蛋白水平的表达;2.通过双荧光素酶报告基因活性实验发现沉默Pokemon可抑制MCF7细胞中ERa66启动子的活性表达;3.分别采取100例人非特殊型浸润性乳腺导管癌组织及10例边缘组织和50例不同病理类型的人乳腺癌及50例淋巴结转移癌组织进行免疫组化染色并分析三者之间的相关性,实验结果表明在不同病理类型的人乳腺癌及淋巴结转移癌组织中Pokemon与ER、PR的表达水平具有显著正相关。(P0.05)结论1)沉默Pokemon可抑制乳腺癌细胞(MCF7及T47D)中ER、PR的表达,机制可能与沉默Pokemon能抑制ER启动子活性从而下调ER表达水平有关。2)在人乳腺癌组织及淋巴结转移癌组织中,Pokemon与ER、PR的表达具有显著正相关。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

第 4 章 实验结果第 4 章 实验结果4.1 验证 Pokemon siRNA 对乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞沉默效果为了验证所选择 siRNA 在两细胞系中对 Pokemon 的沉默效果，我们将Pokemon siRNA 通过瞬时转染至乳腺癌 MCF7 及 T47D 细胞中，48 小时后，通过免疫蛋白印迹实验方法检测这二者细胞系中 Pokemon 的表达情况，可以看出，以β-acting 作为参照，转染 siRNA 后有效干扰了 MCF7 和 T47D 细胞中 Pokemon 蛋白的表达水平（图 4.1），说明所选择的 Pokemon siRNA 具有良好的 Pokemon 沉默效果。

究4.2.1 沉默 Pokemon 抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞 ER、PR 的核酸转录水平为了探究沉默 Pokemon 对乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞中 ER、PR 核酸转录效应的影响，我们通过瞬时转染 Pokemon siRNA 分别至 MCF7 及 T47D 细胞中，48 小时后，提取 RNA 并逆转录成 cDNA，通过荧光实时定量 PCR 仪检测对照组(con)及实验组(siRNA）中的 Pokemon、ER 和 PR 的 mRNA 表达情况，实验结果显示：实验组中 Pokemon mRNA 的转录水平较对照组明显下降（图 4.2），敲低 Pokemon 的实验组 ER mRNA 含量较对照组显著下降(图 4.3)；PR 的 mRNA的转录水平也随之降低（图 4.4）。经过统计学分析证实沉默 Pokemon 可抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞中 ERa66、PR 的核酸的转录水平，差异具有统计学意义（p＜0.01）。

图 4.3 沉默 Pokemon 可抑制乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞中 ERa66 mRNA 水平的表达注：con 组：对照组，siRNA 组：实验组，瞬时转染 Pokemon siRNA48 小时后，n=3，***P < 0.001，**P < 0.01表4.2 Pokemon 对乳腺癌MCF7和T47D细胞中ERa66核酸转录水平影响(Mean±SD)组别 核酸转录水平MCF7cell con 0.4902±0.0178siRNA 0.1253±0.0025T47Dcell con 0.1114±0.0045siRNA 0.0580±0.0045
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本文编号：2884234