PDGF-BB因子诱导口腔黏膜成纤维细胞活化的作用及机制研究

发布时间：2020-11-15 20:50

　　 [目的]肿瘤演进过程中,肿瘤细胞与基质细胞的相互作用备受关注。与正常成纤维细胞相比,肿瘤基质中的成纤维细胞即癌相关成纤维细胞处于活化状态,但其活化机制尚不明了。本研究通过建立口腔癌细胞与成纤维细胞共培养模型,探索血小板源性生长因子BB及其受体(PDGF-BB/PDGFR-β)介导癌细胞诱导成纤维活化的作用及相关机制,从基质角度阐明肿瘤演进机理并诠释癌细胞与基质成纤维细胞的内在关系及其分子事件,为探索通过干预PDGF-BB/PDGFR-β通路防治肿瘤提供实验依据。[方法](1)细胞培养常规培养正常人口腔黏膜角质化细胞hOMK(Normal human Oral Mucosa(P2)500K Keratinocytes cells,新加坡 Cell Research Corp)、人口腔舌鳞癌细胞Cal-27(美国ATCC)、正常人口腔黏膜成纤维细胞hOMF(Normal human Oral Mucosa(P3)500K fibroblast cells,新加坡 CellResearch Corp)。(2)上皮细胞差异分泌因子筛选用RayBio QAH-CAA-1000芯片杂交技术检测hOMK及Cal-27细胞分泌因子,筛选差异分泌因子,并用ELISA验证。(3)条件培养基的制备hOMK及Cal-27细胞分别接种至150ml培养瓶,当细胞生长汇合达约80%时,更换新的完全培养基持续孵育24h,收集细胞上清液,4℃、15000g离心30min去除细胞碎片,0.22μm直径微孔滤膜除菌,-20℃保存以备用。(4)成纤维细胞活化诱导用含有30ng/ml PDGF-BB因子的完全培养基或1/3体积Cal-27细胞上清和2/3体积的完全培养基对成纤维细胞进行培养,每3天传代处理一次,传代处理3次后,对各组成纤维细胞生物学特性进行分析,获得活化的成纤维细胞(AF)。(5)在倒置显微镜下观察细胞生长状态,HE染色后光学显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察微管及致密斑等亚细胞结构。(6)免疫荧光染色检测成纤维细胞PDGFR-β的表达。(7)成纤维细胞趋化因子分泌检测趋化因子芯片检测正常成纤维细胞和活化成纤维细胞分泌的趋化因子,筛选差异分泌的趋化因子,行ELISA和qPCR验证。(8)成纤维细胞miRNAs表达检测Human Cancer Focus microRNATarget mRNA PCR Array 芯片检测正常成纤维细胞和活化成纤维细胞miRNAs表达,筛选差异表达miRNAs,行qPCR验证。(9)生物信息学分析及双荧光素酶检测根据芯片筛选差异表达结果(hsa-miR-26a-5p),通过生物信息学网站(http://www.microma.org.)查询预测 miRNA-26a-5p 可结合 TAB3-3'UTR。将hsa-miR-26a-5pmimics(mimics NC 为对照)与预测靶基因 TAB3-3'UTR 野生型和TAB3-3'UTR的突变型分别用荧光素酶报告载体瞬时共转染AF细胞,检测双荧光素酶活性,验证miR-26a-5p抑制靶基因TAB3翻译水平。(10)质粒构建及转染以miRNA-26a-5p系列为模板,构建过表达载体,转染AF细胞[AF-ZsGreen-Puro-miRNA-26a-5p],以空载质粒[AF-ZsGreen-Puro]为对照;构建表达抑制载体,转染 hOMF 细胞[hOMF-ZsGreen-Puro-miR-26a-5p inhibitor],空载质粒[hOMF-ZsGreen-Puro]为对照。(11)免疫印迹检测成纤维细胞TAB3、NF-κB(p65,p-p65)及β-SMA表达。(12)所得数据结果都以均数±标准差(Mean±SD)统计。两组间比较用t检验,多组间比较用方差分析,p0.05有统计学意义,p0.01统计学有显著差异。采用 Graphpad Prism 5.0(Graphpad software.San Diego,SA)对数据进行处理和分析。[结果](1)口腔舌鳞癌细胞Cal-27分泌上清诱导成纤维细胞活化成纤维细胞经过Cal-27细胞分泌上清刺激后,其生长速度加快,接触抑制消失;细胞内微管及致密斑增加;活化标志蛋白α-SMA表达增加,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05);PDGFR-β受体表达增加。(2)口腔舌鳞癌细胞高分泌PDGF-BB因子蛋白芯片检测发现口腔舌鳞癌细胞上清中PDGF-BB因子浓度是正常口腔黏膜上皮细胞上清中的5.7倍,差异具有统计学意义(p0.05)。用ELISA检测PDGF-BB因子,结果与芯片杂交实验结果相似,差异有统计学意义(p0.01)。(3)PDGF-BB诱导成纤维细胞增强趋化因子CCL25的分泌采用趋化因子芯片检测发现,hOMF细胞经PDGF-BB刺激后细胞上清中趋化因子CCL25浓度明显升高,是对照组的1.8倍,差异有统计学意义(p0.05);行q-PCR和ELISA进一步检测,与芯片杂交结果相似,差异有统计学意义(p0.01)。(4)PDGF-BB诱导成纤维细胞下调miR-26a表达芯片检测筛选发现,hOMF细胞经PDGF-BB刺激后hsa-miR-26a-5p表达与对照组相比出现明显下调(p0.05)。行qPCR进一步检测得到相同的结果,差异有统计学意义(p0.05)。(5)口腔舌鳞癌诱导成纤维细胞TAB3高表达、NF-κB磷酸化。hOMF细胞经Cal-27细胞上清刺激后,免疫印迹检测发现TAB3和NF-κ B磷酸化蛋白(p-p65)表达明显上调,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05)。Cal-27细胞上清刺激的同时,分别加入PDGF-BB抗体阻断剂和PDGFR-β受体抑制剂后,与对照组相比,TAB3和NF-κB磷酸化蛋白表达上调均受抑制,差异有统计学意义(p0.05)。(6)miR-26a-5p 负性调控 TAB3生物信息学分析显示miRNA-26a-5p可结合TAB3-3'UTR。双荧光素酶进一步检测发现在活化成纤维细胞中,TAB3-WT-hsa-miR-26a组荧光值较TAB3-WT-mimicsNC组低,差异有统计学意义(p0.05),而miRNA-26a-5p对含TAB3-3'UTR mutant片段的荧光素酶报告基因表达水平无抑制作用。(7)miR-26a-5p功能缺失促进成纤维细胞活化免疫印迹检测发现 hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor 组细胞的α-SMA、TAB3和NF-κB(p-p65)蛋白表达量与hOMF-ZsGreen-Puro组细胞相比明显上调,差异有统计学意义(p0.05)。经 PDGF-BB 刺激后,hOMF-hsa-miR-26a-5p inhibitor组细胞较空白组α-SMA、TAB3和NF--κB(p-p65)蛋白表达量明显上调,差异有统计学意义(p0.01)。(8)miR-26a-5p功能获得逆转及抑制成纤维细胞活化免疫印迹检测发现AF-hsa-miR-26a-5p组细胞的α-SMA、TAB3、NF-κB蛋白表达量与AFs-ZsGreen-Puro组细胞相比明显下调,差异有统计学意义(p0.05)。进一步发现 AF-ZsGreen-Puro 组细胞经 PDGF-BB 刺激后,α-SMA、TAB3和 NF-κB(p-p65)蛋白表达量明显上调;而 AF-ZsGreen-Puro-hsa-miR-26a-5p 组细胞经PDGF-BB刺激后,α-SMA、TAB3、NF-κB(p-p65)蛋白表达量与AF-ZsGreen-Puro组相比上调明显减弱,差异有统计学意义(p0.01)。[结论]PDGF-BB是口腔黏膜成纤维细胞活化关键诱导因子,其可能通过与其受体结合,下调miR-26a-5p表达,解除miR-26a-5p对TAB3靶向抑制作用,从而激活NF-κB信号通路,诱导成纤维细胞活化。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

?处理３次后，倒置显微镜下观察成纤维细胞，结果与对照组相比，活化的成纤维??细胞生长速度加快及接触抑制消失（图１）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐ?—?—?＋??■■圓??图１成纤维细胞倒置显微镜观察（ｘｌＯＯ）??以上各组细胞进行细胞爬片，经丙酮固定、ＨＥ染色、封片等处理后，光镜下??观察成纤维细胞的形态变化，结果发现经Ｃａｌ－２７细胞上清刺激后成纤维细胞的??胞浆突起增多，核深染，而空白组和ｈＯＭＫ细胞上清组成纤维细胞的形态无明??显变化（图２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??图２成纤维细胞细胞形态光镜观察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同时，提取以上各组细胞经２．５％戊二醛固定、脱水、包埋、固化、切片、染??色和透射电子显微镜下观察，结果发现Ｃａｌ－２７细胞分泌上清刺激的成纤维细内??的微管及致密斑增加

观察成纤维细胞的形态变化，结果发现经Ｃａｌ－２７细胞上清刺激后成纤维细胞的??胞浆突起增多，核深染，而空白组和ｈＯＭＫ细胞上清组成纤维细胞的形态无明??显变化（图２）。??ｈＯＭＫ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?＋?—??Ｃａｌ－２７?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?—?—?＋??：＞Ｖ?＊ｖ?１??，．ｖ．？二ｒ?：?．?－?Ｖ?：－?＾??？?＾Ｖ＊?ｒ－ｖ?／■＇ＶｖｒＶ－??图２成纤维细胞细胞形态光镜观察（ＨＥ染色，ｘｌＯＯ）??同时，提取以上各组细胞经２．５％戊二醛固定、脱水、包埋、固化、切片、染??色和透射电子显微镜下观察，结果发现Ｃａｌ－２７细胞分泌上清刺激的成纤维细内??的微管及致密斑增加，而空白组和ｈＯＭＫ细胞上清刺激组的成纤维细无明显变??化。以上结果提示舌鱗癌细胞分泌的上清能影响成纤维细胞的生长和形态结构的??变化。??２７??

２．成纤维细胞ａ－ＳＭＡ表达检测结果??经过舌鱗癌细胞分泌上清的诱导，成纤维细胞的生长、形态及亚细胞结构都??发生了明显的变化，表现为活化的趋势。为了进一步探索舌鳞癌细胞分泌上清能??否诱导成纤维细胞活化，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测成纤维细胞活化的标志蛋白ａ－ＳＭＡ??表达的情况，使用含有２／３完全培养基和１／３?Ｃａｌ－２７细胞分泌上清或ｈＯＭＫ细胞??分泌上清的条件培养基分别常规培养成纤维细胞，经过７２ｈ培养后传代，连续传??代３次后，分别提取细胞总蛋白行免疫印迹检测，结果发现Ｃａｌ－２７细胞分泌上??清刺激的成纤维细ａ－ＳＭＡ蛋白条带较对空白组表达增强，差异具有统计学意义??（ｐ＜０．０５），而ｈＯＭＫ细胞上清刺激的成纤维细胞表达ａ－ＳＭＡ免疫印迹结果较空??白组无明显的差异（图４、５、表１）。该结果说明舌癌细胞分泌上清可使成纤维??细胞的活化标志蛋白ａ－ＳＭＡ表达增强，提示舌鳞癌细胞分泌上清具有活化成纤??维细胞的作用。??
【参考文献】

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1 曾炳恬;;PDGF-BB及其受体PDG-FR-β的表达与非小细胞肺癌淋巴道转移的相关性研究[J];当代医学;2014年28期

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3 孙大康;安新业;李彩玉;宿振国;刘永云;;衔接蛋白TAB1/2/3对NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响[J];现代免疫学;2011年03期

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本文编号：2885189