血小板在肝癌微环境的积聚促进肝癌进展的机制研究

发布时间：2020-11-16 10:01

　　 研究背景和目的原发性肝癌是全世界范围内第六大常见恶性肿瘤及男性第二大致死性肿瘤。其中半数以上新发病例和死亡病例在我国,肝癌是严重威胁我国人民健康和生命的恶性疾病。肝癌的发生多以慢性肝脏疾病为基础,是一个多基因、多因素参与的动态演变的过程。越来越多证据显示肝癌微环境对肝癌的起始和进展具有重要调控作用。因此,深入研究肝癌微环境中肝癌细胞与间质细胞或间质成分间的相互作用,并阐明肝癌微环境调控肝癌细胞生物学行为的分子机制,对寻找有效的肝癌防治靶点具有重要意义。血小板是机体凝血系统的主要成分,同时还参与了组织损伤修复以及炎症反应等过程。近年来陆续有研究报道血小板参与了肿瘤发生发展的多个过程。血液中的血小板与循环肿瘤细胞相互作用对肿瘤细胞的存活、上皮间质转化以及穿出血管进入组织均具有至关重要的作用。另外血小板也存在于某些实体肿瘤如卵巢癌、结肠癌等的肿瘤微环境中,并与肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤相关炎症以及化疗抵抗等过程相关。因此肿瘤相关血小板是非常有前景的潜在肿瘤治疗靶点。多项临床以及实验研究已证明清除血小板或抑制其活化可明显抑制肿瘤生长和转移,但潜在的出血风险限制了抗血小板疗法的临床应用。因此,寻找可有效阻断血小板-肿瘤细胞相互作用且不影响血小板正常生理功能的靶点对肿瘤治疗意义重大。肝脏是调控血小板生成和清除的重要器官。越来越多证据显示血小板在肝脏稳态维持以及多种肝脏疾病病理、生理过程中起关键作用。慢性肝病患者常伴有血小板数量或质量的异常,已有临床研究显示血小板计数与肝癌患者的预后呈负相关,与癌栓形成正相关。这些研究提示血小板在肝癌发生发展中可能有不可忽视的作用。但是,血小板在肝癌发生发展中的作用还未阐明,肝癌微环境中的血小板如何影响肝癌细胞生物学行为还需进一步研究。肿瘤干细胞是一群具有干细胞/起始细胞特性的细胞,与肿瘤的起始、自我更新、分化以及化疗抵抗等密切相关。肿瘤干细胞作为肝癌治疗潜在靶点,受到越来越多研究者的关注。尽管现已发现多种调控肝癌干细胞特性的相关转录因子和信号通路,肿瘤微环境对于激活和维持肝癌干细胞特性的调控作用及机制还不明确,血小板对肝癌干细胞的调控作用尚未见报道。本课题首先观察了血小板在肝癌微环境中的积聚情况,分析了其与肝癌患者的临床指标及预后的相关性,进一步通过抑制血小板在肝癌微环境中的积聚阐明其对肝癌进展的影响及潜在机制,以期为实现临床精准血小板干预提供实验室证据,为肝癌的防治提供新的安全有效靶点。研究方法1.建立Hepa1-6细胞小鼠肝脏原位种植瘤模型、癌基因诱导(c-Met和组成性激活β-Catenin)的小鼠肝癌模型以及人肝癌细胞系Huh7裸鼠皮下荷瘤模型,检测血小板在实验性肝癌中的积聚情况;2.在肝癌患者术后的组织样本中进行血小板特异染色,检测血小板在人肝癌组织中的分布情况;3.收集肝癌患者肿瘤组织标本及临床病例资料和预后资料,制作组织芯片,通过免疫组化法进行血小板特异标志物CD42b染色,分析肿瘤组织内血小板聚集情况与患者总体生存期和无瘤生存期的相关性;并分析外周血小板计数与肿瘤组织内血小板聚集情况的相关性;4.应用抗血小板药物及清除抗体抑制血小板在肿瘤微环境中的积聚,检测该处理对Hepa1-6细胞小鼠肝脏原位种植瘤模型、癌基因诱癌模型以及Huh7细胞裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生长的影响;并通过免疫组化方法检测肿瘤组织内增殖和干性相关标志物的表达情况;5.建立血小板-肝癌细胞共培养模型,分析体外条件下血小板对肝癌细胞增殖、迁移、化疗药物抵抗以及干细胞表型的影响;6.通过Western Blot、免疫荧光、定量PCR、小分子抑制剂及RNA干扰等方法研究确定NF-κB/IL-6/STAT3信号通路在血小板促进肝癌干细胞表型中的作用;7.通过血小板与肝癌细胞分隔共培养以及应用凝血酶(thrombin)活化血小板得到的上清和沉淀分别处理肝癌细胞的方法,明确血小板是通过分泌细胞因子还是通过直接接触影响肝癌干细胞表型;8.利用血小板相关黏附分子的中和抗体研究何种黏附分子介导了血小板引起的肝癌干细胞扩增;9.在Huh7细胞裸鼠皮下荷瘤模型中应用血小板黏附分子中和抗体,观察其对肿瘤生长的影响。结果1.Hepa1-6细胞小鼠肝原位移植瘤模型、癌基因诱癌模型和裸鼠Huh7皮下肿瘤组织中均存在血小板的积聚;2.临床肝癌组织中存在不同程度的血小板积聚;3.肝癌微环境中的血小板积聚程度与肝癌患者术后总体生存期和复发时间存在负相关;肝癌微环境中的血小板积聚程度与外周血小板计数呈正相关;4.抑制肝癌微环境中的血小板积聚能显著抑制Hepa1-6细胞原位移植瘤、癌基因诱发肿瘤和裸鼠皮下肿瘤的生长,并可显著抑制肿瘤细胞增殖以及肝癌干细胞的扩增;5.血小板-肝癌细胞体外共培养,促进了肝癌细胞的增殖、迁移、化疗药物抵抗以及肝癌干细胞表型等生物学行为;6.血小板通过与肝癌细胞共培养激活肝癌细胞内NF-κB信号通路,促进IL-6产生,后者进一步激活肝癌细胞内JAK2/STAT3信号通路,从而活化和维持肝癌干细胞表型;7.血小板通过与肝癌细胞直接接触的方式激活了NF-κB/IL-6/STAT3信号通路;8.血小板表面分子P-selectin介导了血小板引起的肝癌细胞内NF-κB/IL-6/STAT3信号通路的活化;9.应用P-selectin中和抗体可明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,且对小鼠凝血功能没有影响。结论本研究结合肝癌患者的临床随访资料、体内和体外实验证实了肝癌微环境中血小板积聚在促进肝癌进展中的关键作用。肝癌微环境中血小板通过其表面分子P-selectin与肿瘤细胞直接相互作用,激活肿瘤细胞内的NF-κB信号通路并诱导IL-6的生成,后者通过自分泌和旁分泌等方式进一步活化肿瘤细胞内JAK2/STAT3信号通路,最终促进了肝癌干细胞的扩增和肝癌的进展。阻断P-selectin可在不影响血小板凝血功能的同时阻断血小板-肿瘤细胞的相互作用从而影响肝癌的进展。本研究提示P-selectin是肝癌防治的潜在安全有效的靶点,为肝癌患者的个体化治疗提供了新的理论依据和新策略。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

海军军医大学博士论文血小板聚集的现象（TCIPA）[11]，其机制与肿瘤细胞释放的一些蛋白酶和组织因子相关，包括凝血酶、组织蛋白酶 B 和金属蛋白酶（MMP-2/MMP-14）等有关[14]。肿瘤细胞与血小板间的相互作用主要依赖于其表面的黏附分子，包括 GPIb–IX–V 和GPIIb/IIIa 等，至今已在 MCF7 乳腺癌细胞、B16 黑色素瘤细胞和 3LL 肺癌细胞中得到证实[15, 16]。纤维蛋白原也可介导GPIIb/IIIa与肿瘤细胞表面整合素 vβ3间的结合[17]。P-selectin 则可以与肿瘤细胞表面粘蛋白发生相互作用[18]。越来越多的研究发现 TLR4在 TCIPA 和血小板促进肿瘤转移过程中都扮演十分重要的角色[19]。

在维持微血管的稳态中有重要作用，它们在不同器官/组织的密度有所不同[38]。此外，周细胞也有收缩和吞噬功能，有助于维持内皮细胞的屏障功能和基底膜的形成，提高新生血管的稳定性。在肿瘤的转移方面，目前研究发现周细胞有互为矛盾的双重作用，即既限制又促进肿瘤的转移。一方面肿瘤血管周围周细胞的覆盖可能是减少肿瘤细胞经血管漏出的重要因素，另一方面，它也帮助肿瘤细胞在复杂的血管网络中经微血管转移[39, 40]。血小板在微环境中对周细胞的作用还不是很清楚，但是血小板内储存和分泌的多种因子，包括 TGF-β1、PDGF 和 AGPT-1，可以影响周细胞的分化、增殖、募集以及与内皮细胞间的相互作用。在 B16/F10 肿瘤小鼠中出现血小板减少症，肿瘤内血管周细胞覆盖减少并且肿瘤血管的密度降低，血管通透性增加。血小板减少使肿瘤内 TGF-β1、VEGF 和 ANGPT-1 水平降低，但是 ANGPT-2 水平升高[41]。出乎意料的是，血小板减少使血管密度降低对原发肿瘤的生长没有影响，但是却减少了肺转移。周细胞的功能和覆盖血管方式取决于器官/组织类型，血小板如何影响肿瘤微环境中的周细胞可能也与肿瘤类型以及解剖位置相关。

促进肿瘤侵袭转移[46]。够诱导 EMT 作用，有研究还发现血小板在早期转移灶形成中也有]。血小板来源而非肿瘤细胞来源的的趋化因子 CXCL5/7，是早期所必须的[51]。相类似的研究中发现，血小板来源的趋化因子作用够维持其间叶细胞的表型促进肿瘤转移[52]。因此可见，血小板不长的信号并且可以协助原发灶肿瘤细胞到达远处器官形成转移灶泌TGFβ1和趋化因子之外，活化后的血小板还能够分泌autotaxin（有磷脂酶 D 活性的酶，可以从溶血磷脂酰胆碱中分解出 LPA，有管生成和转移[53-55]。血小板来源的微粒中含有 micro-RNA-233，可癌基因 EPB41L3 的表达进而增强肺癌细胞的侵袭能力[56]。因此微环境“种子与土壤”的学说之上，肿瘤转移的微环境则可形容为“”，血小板就是转移所不可或缺的“肥料”。总之，血小板促进肿瘤以下两个方面：首先是通过与肿瘤细胞直接作用，协助并趋化肿瘤；其次是分泌多种生长因子直接促进植入肿瘤细胞，为其生长提供细胞能够在此安家。（如图 3 所示）
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本文编号：2886003