miRNA-155在胆囊癌中的表达及索拉非尼干扰其表达对人胆囊癌细胞生物学行为及预后的影响

发布时间：2020-11-17 16:22

　　 研究背景:目前,随着人类社会的变化,恶性肿瘤的发病率日趋增加,尤其是胆道系统中的胆囊癌,对人类身体健康构成了非常大的威胁。随着近现代医学技术的不断发展,对胆囊癌症疾病的发病有了全新的认知,在早期诊断方面更及时化、规范化,为患者良好治疗及预后提供了重要的指导意义。相关的研究结果显示,在人类的调节基因中,miRNAs调节占比大约60%,其中主要的因子包括:原癌原因、肿瘤抑制因子等。上述比例,充分展示了 miRNAs和肿瘤之间的相关性。目前,微小RNA(miRNA)作为调节生物体中许多关键基因表达的基因研究越来越深入。miRNA是一种非编码单链RNA,包含20-25个核苷酸,它们通过与靶向mRNA的3'-非编码区结合,再转录,调节基因表达。在细胞中,RNA-poly II将miRNA转录成初级miRNA转录物,然后转运到细胞核中,由Drosha酶生成miRNA前体,其、后者在细胞质中被加工成成熟的miRNA。miRNA可发挥多种生理功能,可以调节细胞发育,增殖和分化,细胞凋亡,参与各种免疫应答,炎症过程,也可参与一些自身免疫系统疾病和某些癌症基因的表达。此外,在很多临床标本和癌症组织中MiRNA能够保持长期的稳定性,所以miRNA可以用作某些癌症预后的生物学标志物。miR-155位于人类第21号染色体的非编码转录区第3个外显子内,由RNA聚合酶(RNA-polymerase)转录成前体 miRNA(pre-cursor miRNA,pre-miRNA),后者具有聚腺苷酸尾和帽结构的短发夹样结构。细胞核中,Drosha复合酶将其进一步改造,使其转化为60至70nt大小的核苷酸,然后在细胞质中由DNA切割酶活化,最后产生约21-25nt大小的短miRNA。miRNA-155具有多种生物学功能,其主要功能主要体现在基因转录后和翻译前调节,进而影响各种大分子物质的表达。在一般情况下,成熟miRNA-155在T细胞和B细胞中表达,其它参与表达的还有单核细胞和巨噬细胞等。后来,越来越多的研究证实miRNA-155的表达异常与许多疾病如癌症,心血管疾病,炎症,自身免疫疾病等相关。研究发现,在乳腺癌、白血病、甲状腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌和肾细胞癌等各类型的肿瘤中,miR-155均在此类恶性疾病的过度表达。以前,Kono等学者也提出了在胆囊癌中,miR-155有过度表达。在胆囊癌的发展过程中,miR-155体现出来的表达水平,与患者的淋巴转移,以及预后情况,均显示了二者之间明显的相关性。另外,有相关的试验证明,miR-155的异常表达,也明显增强了胆囊癌细胞的侵袭性。然而,miR-155在中国人群胆囊癌中的临床意义还没有研究过。目前,关于胆囊癌的发病机制却未明确,治疗的手段也比较单一,大多都是以手术切除的方式为主。但是,由于发病症状并不明显,临床症状也非常隐秘,因此,此类疾病的初期诊断率并不高。临床上80%以上的患者在明确诊断时已属中晚期,然而在大部分患者通过采取手术治疗后,效果并不佳,甚至术后的复发率高达50%。由此可见,对于胆囊癌的化疗手段显得非常十分重要。本研究将在已有的研究基础上,从细胞和机体两个水平探究在胆囊癌患者中,miRNA-155的表达水平对索拉非尼化疗效果的影响。目的:采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-PolymeRase Chain Reac-tion,RT-PCR)的方法,测定人胆囊癌组织及正常的胆囊组织中miR-155的表达。观察miR-155有无异常表达及其在人胆囊癌诊断与治疗中的临床意义。(2)研究索拉非尼对人胆囊癌GBC-SD细胞和胆囊癌患者的作用以及与miRNA-155表达的关系。方法:(1)选取我院2008年5月至2014年4月间行胆囊癌手术治疗的病人,术前均未经放疗及化疗,术后通过RT-PCR法测定胆囊癌组织和正常胆囊组织miR-155的表达。梅耶生存曲线(Kaplan-Meier)法,分析患者术后5年生存率。(2)索拉非尼处理GBC-SD细胞:分为正常细胞对照组、GBC-SD细胞组和不同剂量索拉非尼处理组(剂量分别为3、6和12 μmol/l)。采用RT-PCR法测定相应细胞中miR-155的表达水平;采用四氮唑盐还原(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测GBC-SD细胞的凋亡情况。(3)选取本院收治的26例接受索拉非尼化疗的胆囊癌患者,术后取癌组织及癌旁组织检测miR-155表达,分析miR-155的表达水平变化及其与患者预后的相关性。结果:(1)miR-155在胆囊癌组织和正常胆囊组织中的表达:133例胆囊癌组织中miR-155的表达水平,均明显高于正常胆囊组织,差异具有统计学意义(P0.01)。miR-155表达水平与临床病理特征:miR-155高表达与TNM分期(P = 0.003),淋巴结转移(P = 0.042),肝脏转移(P = 0.010),以及分化程度(P0.001)等密切相关。miR-155表达和其他临床病理因素,包括性别,年龄(所有P0.05,表1示)之间没有显著关联。miR-155表达与患者的生存相关性:与miR-155低表达的患者比,miR-155高表达的胆囊癌患者,其总体生存期明显更长,差异具有统计学意义(P= 0.03)。另外胆囊癌患者术后总生存期的影响因素很多,多因素分析发现,miR-155表达水平高低可以作为其独立预后因素之一。(HR=2.394,95%CI:1.568-10.034;P = 0.009)。(2)索拉非尼对人胆囊癌GBC-SD细胞活性的影响:MTT检测结果显示,不同浓度(3、6和12μmol/l))索拉非尼处理GBC-SD细胞不同时间(24、48和72h)后,GBC-SD细胞活性均受到不同程度的抑制,其抑制作用随作用浓度和时间的增加而增强,其中以12 μmol/L作用72h时,抑制率为79.96±7.53%,抑制作用最强。(3)索拉非尼对人胆囊癌细胞凋亡的影响:流式细胞仪分析索拉非尼对GBC-SD细胞凋亡的影响,在不同剂量的索拉非尼处理下,GBC-SD细胞的凋亡率变化明显,在3、6和12 μmol/1的索拉非尼处理组中,GBC-SD细胞的凋亡率依次是17.46±2.1%、28.64±4.9%和57.47±8.03%,与对照组相比,各个剂量索拉非尼处理组GBC-SD细胞的凋亡率差异均具有统计学意义(P0.05或PO.01),而且表达出与剂量的相关性。(4)索拉非尼对人胆囊癌细胞GBC-SD miR-155表达的影响:在正常胆囊细胞中miR-155表达较低,而在GBC-SD细胞中miR155的表达显著上调(P0.01);与正常对照组相比,GBC-SD细胞经索拉非尼处理后,miR-155的表达又显著下降(P0.01),且表现出一定的量效关系。尤其是在12μmol/L的索拉非尼处理下,miR-155的表达水平和正常对照组差异没有统计学意义(P0.05)。(5)索拉非尼对人胆囊癌患者miR-155表达的影响:在胆囊癌组织中,miR-155表达水平显著高于癌旁正常组织(P0.01)。当患者接受索拉非尼化疗后,患者胆囊癌组织中miR-155表达显著下降,与胆囊癌组比差异具有统计学意义、(P0.01)。(6)索拉非尼对人胆囊癌患者预后的影响:随访发现,患者术后生存时间与TNM分期、淋巴结转移、分化程度以及miR-155表达水平有关。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期胆囊癌患者经索拉非尼化疗后,平均生存时间分别为46.4±8.9和18.5±2.4月,两组患者生存时间之间的差异具有统计学意义(P0.05)。有无淋巴结转移及肿瘤分化程度高、低的患者生存时间也具有统计学差异(P0.05)。尤其在miR-155高表达和低表达的患者中,索拉非尼化疗后生存时间分别是19.4±3.9月和37.6±4.0月,两者之间的差异具有统计学意义(P0.01)。结论:(1)miR-155在胆囊癌组织中表达水平显著高于正常胆囊组织,其高表达与TNM分期、分化程度及肝脏转移、淋巴结转移等密切相关,且miR-155高表达的胆囊癌患者总体生存期明显低于miR-155低表达的患者,提示miR-155高表达可作为中国人群中胆囊癌患者预后不良的一个指标。(2)不同浓度索拉非尼处理GBC-SD细胞后GBC-SD细胞活性均受到不同程度的抑制,细胞的凋亡率明显上升。使用索拉非尼化疗的胆囊癌患者平均生存时间延长,提示使用索拉非尼化疗后GBC-SD细胞miR-155表达水平的下降与其化疗效果和患者的预后生存密切相关。(3)索拉非尼可能通过下调miR-155表达抑制GBC-SD细胞的活性、促进GBC-SD细胞凋亡。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.8
【部分图文】：

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２?Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲线显示ｍｉＲ－１５５水平和胆囊癌患者的：通过ＫａｐｌａｎＭｅｉｅｒ法和对数秩检验法来分析低表达组和高ｉＲ－１５５高表达的胆囊癌患者总体生存期明显低于ｍｉＲ－１５５低２多因素分析预测胆囊癌术后总生存期??Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ?ＨＲ?９５％?Ｃｌ?Ｐ?ｖＡｇｅ?１．３５２?０．４４９－２．０３８?０．Ｇｅｎｄｅｒ?０．４５８?０．２３９－３．１０２?０．ＴＮＭ?ｓｔａｇｅ?２．３９１?１．２８３－９．９９５?０．Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?ｓｔａｔｕｓ?２．３８３?１．２０１－７．９２５?０．Ｌｉｖｅｒ?ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ?１．２９１?１．００１－６．１９２?０．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ｄｅｇｒｅｅ?２．１０２?０．９９３－７．９２７?０．ｍｉＲ－１５５?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?２．３９４?１．５６８－１０．０３４?０．：多因素分析发现ｒａｉＲ－１５５表达水平是胆囊癌患者术后总生５?％ＣＩ：?１．５６８－１０．?０３４；?Ｐ－３?〇．〇〇９）。??表３相应基因的引物列表基因?序列??

１２??Ｓｏｒａｆｃｎｉｂ?（ｊｉＭｏｌ／Ｄ??图３Ｂ索拉非尼对ＧＢＣ－ＳＤ细胞凋亡的影响，与对照组相比，每个剂量索拉非尼处理下ＧＢＣ－ＳＤ??２８??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 石景森;郑见宝;;进一步提高胆囊癌诊治的总体水平[J];临床肝胆病杂志;2013年06期

本文编号：2887694