新城疫病毒F48E9株对肠癌的治疗研究及其反向遗传系统的建立

发布时间：2020-11-17 17:04

　　 有研究报告显示:我国癌症新发人数继续上升,结肠癌患者增长趋势明显。目前在临床上治疗结肠癌的主要措施是手术切除治疗,辅以放射疗法、化学药物疗法和免疫疗法。手术治疗之后,结直肠癌容易发生转移和复发,是结直肠癌引起患者死亡的主要原因。免疫治疗是最有希望的肿瘤治疗方式之一,曾入选《科学》杂志“2013十大科学突破”榜首。基于病毒的溶瘤治疗研究是免疫治疗的重要途径之一,溶瘤病毒可以通过直接感染裂解肿瘤细胞、激活机体免疫系统等多种途径发挥肿瘤的抑制或清除作用,部分溶瘤株已在临床治疗中显示出良好的治疗效果,其中一株改造过的HSV溶瘤病毒已经在美国正式上市。NDV是一种禽类RNA主要感染禽类,偶见患者感染事件,引起结膜炎和温和的流感症状等。从20世纪60年代开始,到如今已有73-T、MTH-68、PV701、HUJ、LaSota等多个NDV减毒株或弱毒株开展了一期和二期药物临床试验,但都没有进入三期临床试验,提示现有的NDV弱毒株或减毒株的治疗效果还不够好,因此,有必要开发疗效更好的NDV溶瘤病毒株。新城疫F48E9株是国内标准强度株,关于F48E9用于溶瘤治疗的研究几乎没有。胡立华等比较了 NDV强毒株F48E9和NDV弱毒株LaSota对大肠癌细胞LS1747的体外杀伤效果,提示F48E9可能具备溶瘤治疗潜能,但是该研究没有在动物水平上评估F48E9的溶瘤抑制效果和治疗安全性。因此,本研究以结直肠癌为模型,研究NDV强毒株F48E9对肠癌细胞的体内外抑制作用,并通过小鼠尾静脉注射病毒评价F48E9体内治疗安全性。结果显示MOI为0.1的F48E9对CT26细胞生长可表现出明显的抑制作用,随着MOI的升高,F48E9对细胞生长的抑制明显加强;0.1 mL浓度为2x107 pfu/mL的F48E9对BALB/c小鼠CT26皮下移植瘤的生长有显著抑制作用,治疗组的平均生存期为38.4天,未治疗组的平均生存期为15.2天;免疫组化实验显示F48E9对CT26小鼠移植瘤细胞的增殖有明显抑制作用;F48E9尾静脉注射正常BALB/c小鼠的安全性评估实验显示,该毒株对小鼠无明显副作用。以上结果提示新城疫F48E9可以作为潜在的溶瘤候选株,用于进一步的溶瘤治疗研究。为了进一步增强新城疫F48E9株的抗肿瘤活性,本研究尝试构建F48E9株反向遗传系统用于对F48E9株进行遗传修饰。首先,对F48E9基因组进行测序,构建各个片段的亚基因组克隆至pblue载体,然后把各个片段构建至同一个pCI-neo载体中,获得F48E9株全长cDNA基因组克隆。同时,构建F48E9株的三个辅助蛋白表达质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P。然后四质粒共转染于BHK21细胞中,并进行血凝反应和空斑实验评估病毒重组效果。经过鉴定,四质粒共转的细胞裂解物有1个单位的血凝反应,但是不能够形成空斑。总之,本研究评估了野生型新城疫F48E9株用于结直肠癌的治疗效果,并进行F48E9株对BALB/c小鼠的安全分析。发现F48E9能够对CT26产生明显的体外抑制效果和显著的体内溶瘤效果,同时对BALB/c没有明显的副作用。本研究还尝试构建F48E9株反向遗传操作系统,用于对F48E9株进行基因组修饰。目前,我们已经获得了 F48E9株全长反义cDNA基因组克隆,以及三个辅助质粒克隆。经过鉴定,转染质粒没有得到具有感染活性rF48E9病毒粒子,还需进一步的优化转染体系。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.3
【部分图文】：

会存在一定的差异。为了获得更加准确的Ｆ４８Ｅ９毒株全基因组序列，为后续的反??向遗传学操作提供依据，本研宄利用现有的Ｆ４８Ｅ９序列重新设计引物（表２－１?）。??按照图示（图２－丨）把Ｆ４８Ｅ９病毒全长基因组分为互相重叠的九段，为了比较准??确地获得病毒基因组３’－ＵＴＲ的序列，单独设置了方向的反转录引物。引物设计??使用Ｏｌｉｇｏ６．０，引物由金唯智公司合成。??培养Ｆ４８Ｅ９病毒，连续空斑纯化５个代次，取反复冻融的病毒液进行ＲＮＡ??的提取和反转录获得Ｆ４８Ｅ９株的ｃＤＮＡ基因组，使用高保真聚合酶进行ＰＣＲ扩??增，每个扩增反应重复３次，釆用天根试剂盒进行ＰＣＲ产物纯化回收。回收的??片段直接送闽博生物公司测序，使用Ｂｉｏ－Ｅｄｉｔ以及ＤＮＡｓｔａｒ等生物学软件进行??序列分析，获得Ｆ４８Ｅ９基因组。??３＇－ＵＴＲ?Ｓ＇－ＵＴＲ??—＂．．．?＞■??２ＺＩ—ｒ￣￣＾??ＰＩ???－＊??ｒｆ〇?＊?Ｆ９??丄?Ｐ２??Ｆ〇?＊????Ｐ７??＾７—－

三果一部分新城疫Ｆ４８Ｅ９用于肠癌的治疗研究??新城疫溶瘤株的培养和滴定??野生型的病毒株多为混合毒株，性质不单一，本实验在前期研宄中对获得的??Ｅ９毒株进行进一步的空斑纯化，并且经过比对Ｆ４８Ｅ９株在不同的宿主细胞??制周期和病毒含量，确认使用Ｖｅｒｏ细胞作为Ｆ４８Ｅ９毒株的生产细胞株。利??城疫Ｆ４８Ｅ９株ＮＰ蛋白单克隆抗体作为一抗进行免疫荧光实验，评价生产的??感染Ｖｅｒｏ细胞的活力（图３－１．Ａ）。使用０．５％小鼠血球进行血凝实验，血??位可以达到１０格，进行空斑形成实验，发现Ｆ４８Ｅ９病毒可以产生明显的空??（图３－１．Ｂ）。经过系列梯度稀释之后进行空斑滴定，获得新城疫Ｆ４８Ｅ９株病毒??为２ｘｌ〇７ｐｆｕ／ｍＬ，分装至病毒冻存管后储存在－８０°Ｃ超低温冰箱中。??Ａ?ＭＯＣＫ?ＮＤＶ－Ｆ４８Ｅ９??

＾?６０?Ｂ?ｔ?＇??ｉ?ｒ?１１１??ｉ??。。七々、ａ?＃?（ｍ〇＿＞??图３－３．?ＮＤＶ－Ｆ４８Ｅ９对ＣＴ２６结肠癌细胞的生长抑制作用??Ｆｉｇｕｒｅ?３－３．?Ｆ４８Ｅ９?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｏｆ?ＣＴ２６?ｃｏｌｏｎ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ??３９??
【参考文献】

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本文编号：2887730