Hsa-miRNA-643调控Raf1影响NSCLC放射敏感性及侵袭转移的初步研究

发布时间：2020-11-18 14:27

　　 目的：探索Rafl的表达水平与非小细胞肺癌(NSCLC)临床因素及预后的关系,体外水平明确miRNA-643靶向调控Raf1对NSCLC细胞侵袭、转移及放射敏感性的影响。方法：免疫组化检测NSCLC患者石蜡标本组织中Raf1的表达,分析Rafl表达与患者临床病理特征、放疗疗效的相关性,风险比例模型(Cox回归)分析影响NSCLC预后的危险因素；采用western blot和RT-PCR方法检测不同NSCLC细胞株中Raf1的表达情况,选择不同表达Rafl的A549和H1299细胞株,通过瞬时转染获得Raf1基因表达上调的A549和表达下调的H1299细胞株,运用CCK8、克隆实验、划痕实验和Transwell小室检测Raf1基因对NSCLC细胞增殖、侵袭、转移及放射敏感性等生物学行为的影响。利用生物信息学在线软件预测调控Raf1的上游miRNA, RT-PCR检测miRNA-643在NSCLC细胞中的表达,双荧光素酶报告系统验证miRNA-643与Raf1的靶向调控关系；拯救实验验证miRNA-643调控靶基因Raf1表达在A549和H1299细胞侵袭、迁移能力和放射敏感性中的作用；同时检测AKT/NF-κB通路及凋亡蛋白的表达变化。结果：1、110例接受根治性放射治疗的NSCLC患者,Rafl蛋白表达49例(44.5%),其中高表达21例(19.1%)、低表达28例(25.5%),Raf1表达水平与肿瘤T分期、淋巴结转移和细胞分化程度呈显著相关(P0.05)；Raf1表达组患者的疾病进展时间和3年总生存期明显差于Raf1不表达组(P0.05)。2、Raf1在H1299细胞中呈相对高表达, 而在A549及H827细胞中表达相对较低。沉默Raf1基因后,H1299细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱,放射敏感性增加；而过表达Raf1基因后, A549细胞增殖、迁移及侵袭能力增加,放射抗拒增加。3、miRanda,TargetScan和TarBase在线预测miRNA-643可能与Raf1存在靶向关系,荧光素酶报告基因实验证实miRNA-643靶向结合Raf1的3'-UTR区。过表达miRNA-643后,在mRNA和蛋白水平抑制Raf1的表达。4、进一步实验显示,利用Raf1表达载体转染使稳定表达miRNA-643的H1299细胞株中Raf1基因拯救性过表达,过表达Raf1可回复由于稳定表达miRNA-643对细胞增殖、侵袭转移及放射抗拒的抑制作用；而在稳定干扰miRNA-643的A549细胞株中,干扰Raf1基因可减少由于miRNA-643低表达后细胞增殖、侵袭转移及放射抗拒。5、Rafl过表达后,AKT及p65的表达及活性上调,EMT标记蛋白E-cadherin表达下调,而Vimentin蛋白上调；Raf1下调,AKT、p65、Vimentin及凋亡蛋白caspase-3和caspase-9下调,而E-cadherin及凋亡蛋白c-caspase-3和c-caspase-9表达上调。结论：Raf1与NSCLC放疗后早期疾病进展及不良预后相关,增加NSCLC恶性进展及辐射抗拒；miRNA-643下调Raf1表达,在肺癌细胞增殖、侵袭转移和放射敏感性方面发挥重要作用；高表达miRNA-643的肺癌细胞的生物学行为活性减弱,具有抑癌作用,增加肺癌细胞放射敏感性,为NSCLC的分子靶向治疗及放射治疗提供新的探索方向。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

生存时间（Ｏｖｅｒａｌｌ?Ｓｕｒｖｉｖａｌ?０Ｓ）发现，民ａｆｌ表达患者的ＴＴＰ和０Ｓ要差于不表达??的患者；利用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析Ｒａｆｌ对ＴＴＰ和３年ＯＳ影响，结果显示Ｒａｆｌ??表达患者出现ＴＴＰ较不表达患者要早（图２Ａ，Ｃ，Ｅ）?；?Ｒａｆｌ表达患者３年ＯＳ要??差于不表达的患者（图２Ｂ，Ｄ，Ｆ），其中Ｒａｆｌ高表达患者与不表达沮间差异有统??计学意义（图２Ｄ）。??Ｙ?１?Ｗ?Ｉ?酱＇??１：?！；??？＊＂?＇?－?＇一１?＇?？？－?Ｉ?Ｉ?■?■?Ｉ?Ｉ?Ｉ??？？?？？?■■?ｍｍ?…?…?一??Ｍａｎｔａ?Ｍｏｎｆｆｎ??Ｄｆ＾ｌ?Ｉ?拍＂Ｅ］?－ｔｕ?｜马￡?Ｆ??Ｉ…１…?ｈ?１…?扳??Ｉ?ＶＨ

Ｗｅｓｔｅｒｎ臥ｏｔ检测民ａｆｌ在各肺癌细胞系中表达的本底水干。ｑＲＴ－ＰＣ民和Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔ检测结果均显示，民ａｆｌ在高转移细胞株Ｈ１２９９中表达最高，在Ａ５４９及Ｈ８２７??中低表达（图３）。??？ｉ?Ｓ－Ｏ＂］?口?Ｈ８２７??＞?誦誦■??里？?？?Ｂ?Ａ５４９??Ｃ?２．５＇????名?■■?Ｈ１巧９??￡?２．０－??Ｉ?＾?５，?ｍｉｌ?Ａ５４９?Ｈ１２９９??￡?Ｔ－?Ｒｇｆ］侧幽＾．?Ｍｆｉｉｂ??ｃ?＇ｎｎｇｉｌ??《０．０－Ｕ?—￣￣Ｉ￣￣￣￣ａｃｔｉｎ?ＰＷｒ???图３：肺癌细胞株中Ｒａ打表达（ｍＲＮＡ水平和蛋白水平显示高转移Ｈ１２９９细??胞中Ｒａ打髙表达，转移偏低Ａ５４９及Ｈ８２７细施中表达偏低）??２．

图４：转染后细胞株中Ｒａ打的表达情况??Ａ和Ｃ：?Ｒａ打在Ａ５４９细胞株中表达较对照沮増高??Ｂ和化Ｒａ打在Ｈ１２９９细胞株中表达较对照组降低??３？改变Ｒａｆｌ表达后肺癌细胞増殖能力明显变化??在检测Ｒａｆｌ基因对肺癌细胞株增殖活性的影响，我们利用转染后的肺癌细胞??Ａ５４９和Ｈ１２９９，使用ＣＣＫ－８法检测细胞增殖能力的改变，结果显示随着培养时??间的延长，上调民ａｆｌ表达的肺癌细胞株Ａ５４９増殖能力明显增强（图５Ａ），敲??低Ｒａｆｌ表达的肺癌细胞株Ｈ１２９９增殖能力明显减弱（图巧），两组间差异有统??计学意义。??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 韩露,李光;生物标记物与放射敏感性[J];国外医学(肿瘤学分册);2001年02期

2 徐永忠,郑斯英,赵经涌,朱巍,王洪海;荧光原位杂交技术检测细胞内在放射敏感性的研究[J];中华放射医学与防护杂志;2002年02期

3 陈暑波;人类放射敏感性的遗传基础[J];国外医学(临床放射学分册);2003年05期

4 高远红,杨伟志,闫洁,袁智勇,刘新帆,徐国镇;“彗星”分析法检测人癌裸鼠移植瘤的放射敏感性[J];中华放射肿瘤学杂志;2004年01期

5 冯瑞;柳永蕾;宋现让;于金明;;分子水平预测肿瘤放射敏感性研究进展[J];肿瘤学杂志;2008年08期

6 罗成基;;用抗血小板血清两次重复注射对小鼠放射敏感性的影响[J];国外医学(放射医学分册);1980年01期

7 高汝贵;;环—磷酸腺甙同放射敏感性[J];日本医学介绍;1983年05期

8 黎文亮,胡文华;人与狗外周血淋巴细胞放射敏感性的比较[J];军事医学科学院院刊;1986年01期

9 刘学成;辐射作用下的免疫状态[J];国外医学(放射医学核医学分册);1990年01期

10 杨星;肿瘤放射敏感性预测方法探索[J];国外医学(肿瘤学分册);1994年05期

相关博士学位论文 前10条

1 邰国梅;TIGAR调节自噬活性影响人脑胶质瘤放射敏感性的机制研究[D];苏州大学;2016年

2 朱宝松;肿瘤相关巨噬细胞的自噬调节对胃癌放射敏感性的影响及机制研究[D];苏州大学;2016年

3 戴静;端粒保护蛋白hPOT1对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及其机制研究[D];武汉大学;2014年

4 田浩;Hsa-miRNA-643调控Raf1影响NSCLC放射敏感性及侵袭转移的初步研究[D];南京医科大学;2016年

5 陈功;microRNA参与脑胶质瘤放射敏感性调节的机制研究[D];南京医科大学;2010年

6 李光;鼻咽癌放射敏感性的预测[D];中国医科大学;2002年

7 卜俊国;表皮生长因子受体对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响[D];第一军医大学;2007年

8 洪金省;磁共振弥散加权成像技术预测鼻咽癌放射敏感性的价值及其机制研究[D];福建医科大学;2012年

9 高远红;Comet Assay检测人癌细胞放射敏感性的研究[D];中国协和医科大学;2002年

10 明越;宫颈癌细胞株放射敏感性研究[D];北京协和医学院;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 邱子丹;siRNA干扰EGFR表达对食管鳞癌和腺癌放射敏感性影响[D];福建医科大学;2015年

2 姚亦帆;长链非编码RNA-X53654对肺上皮增殖、迁移和放射敏感性的影响及机制的研究[D];苏州大学;2015年

3 郭银;尼妥珠单抗对食管鳞癌ECA-109细胞放射敏感性的影响及机制研究[D];河北医科大学;2015年

4 袁小鹏;抑制STAT3通路对人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其作用机制研究[D];苏州大学;2015年

5 苏玉飞;自噬诱导对大肠癌细胞放射敏感性的影响[D];苏州大学;2015年

6 郑安平;COX-2、XRCC1及RASSF1在食管鳞癌中的表达及其与放射敏感性的研究[D];河南科技大学;2015年

7 邱隽;SiRNA、Apigenin、LY294002、Wortmannin 抑制GLUT-1及PI3K/Akt信号通路影响喉癌放射敏感性体内研究[D];浙江大学;2015年

8 杨文影;抑制MUC1胞内段对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及机制研究[D];重庆医科大学;2015年

9 李阳;人肺腺癌放射抗拒细胞株H1299R的建立及miR-183调控HIF-1α影响H1299R放射敏感性的初步研究[D];遵义医学院;2016年

10 刘伟;长链非编码RNA-UCA1对大肠癌细胞放射敏感性的影响及其机制初探[D];苏州大学;2016年

本文编号：2888820