在结直肠癌细胞与间质成纤维细胞相互作用中肿瘤细胞Cx43异常表达及功能探究

发布时间：2020-11-19 04:12

　　 作为最常见的恶性肿瘤之一,结直肠癌在世界范围内死亡率居高不下,其主要原因是肿瘤的复发和转移问题一直未能很好解决。肿瘤微环境对结直肠癌的作用越来越受到关注。癌相关成纤维细胞是肿瘤微环境重要组成成分之一。前期实验我们已经发现癌相关成纤维细胞(CAFs)能够促进结直肠癌细胞侵袭和迁移,发挥促癌作用;正常成纤维细胞(NFs)能够抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移,发挥抑癌作用,并证实Cx43参与其中。那么Cx43在成纤维细胞和肿瘤细胞相互作用过程中到底发生了哪些变化?其变化的意义何在?这将是本研究中需要解决的问题。本研究继续借助我们已经建立的微环境细胞模型,即成纤维细胞上清条件培养肿瘤细胞,在已有实验的基础上,深入探究Cx43在肿瘤-间质相互作用发挥的功能及可能机制。结直肠癌细胞选用肿瘤细胞系SW620,SW480和RKO,成纤维细胞选用人胚肺成纤维细胞系HELF和用TGF-β人工活化的HELF以及从结直肠癌病理标本中分离提纯的原代正常成纤维细胞NFs和癌相关成纤维细胞CAFs。研究首先成功建立肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用模型,将肿瘤细胞用成纤维细胞上清条件共培养,通过Western Blot方法证实SW620细胞经NFs上清条件培养2d和4d,其上皮标记物E-cadherin在培养4d时表达上调显著,间质标记物Fibronectin表达下调且Vimentin在培养2d和4d时表达均下调显著,Wnt通路相关蛋白DVL3表达下调且Phospho-β-Catenin(s552)s552在培养2d和4d时表达均下调显著;双荧光素酶报告基因活性实验证实肿瘤细胞经NFs上清条件培养2d,Wnt信号通路被抑制。Western Blot实验结果显示SW620细胞经HELF及CAFs上清条件共培养2d和4d,Cx43表达上调,尤以第4d更明显。其次,通过成功构建结直肠癌细胞Cx43稳定敲降及稳定过表达载体,进一步研究Cx43功能。Transwell细胞体外侵袭实验证明,胞浆高表达Cx43的SW620细胞侵袭和迁移能力减弱,胞浆低表达Cx43的SW480细胞侵袭和迁移能力增强。CCK8细胞增殖实验证实胞浆高表达Cx43的RKO细胞增殖能力减弱。GSEA分析证明Wnt信号通路相关基因在RKO细胞胞浆Cx43低表达处富集。但是TCGA和GEO mRNA数据库却证实结直肠癌样本中高表达GJA1(编码蛋白Cx43)呈现不良预后。TCGA mRNA数据库相关性分析显示在结直肠癌样本中,GJA1与EMT上皮标志物CDH1(编码蛋白E-cadherin)呈负相关,与间质标志物CDH2(编码蛋白N-cadherin)及VIM(Vimentin)呈正相关。随后通过TCGA数据库信息证实在结直肠癌样本中GJA1与CTNNB1(编码蛋白β-catenin)呈正相关。免疫共沉淀实验证实Cx43与β-catenin相互作用。激光扫描共聚焦显微镜显示与NFs上清条件培养,SW480细胞中Cx43胞浆表达增加,Cx43未入核;与CAFs上清条件培养,SW480细胞中Cx43发生入核,与β-catenin共同在核内定位。对SW620细胞进行相同处理得到一致的结果。进一步实验发现TGF-β促进结直肠癌细胞Cx43入核。Transwell细胞体外侵袭实验证明,核内表达Cx43的SW480细胞侵袭和迁移能力增强。双荧光素酶报告基因活性实验证实CAFs促进SW620细胞Wnt信号通路活化。直接用TGF-β刺激SW620得到相同的结果。通过上述实验,我们得到以下结论:1.NFs抑制结直肠癌细胞EMT及Wnt信号通路,CAFs促进结直肠癌细胞Wnt信号通路活化;2.CAFs显著上调肿瘤细胞Cx43表达;3.胞浆高表达Cx43的肿瘤细胞侵袭、迁移及细胞增殖能力减弱,Wnt信号通路被抑制,而胞核表达Cx43的结直肠癌细胞侵袭和迁移能力增强,Wnt信号通路被活化;4.CAFs借助TGF-β促进肿瘤细胞Cx43入核,在核内与β-catenin发生相互作用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.3
【部分图文】：

常上皮细胞发生癌变形成肿瘤细胞。肿瘤细胞与其周围的免疫细胞、血管、成纤维细??同构成肿瘤微环境。??隙连接蛋白４３?（ｃｏｎｎｅｘｉｎ?４３，?Ｃｘ４３）是连接子蛋白家族的一员，也是人体??最广泛的连接子蛋白。Ｃｘ４３是一种４次跨膜蛋白，其羧基端和氨基端均位??中，包含２个胞外环和１个胞内环｜９。Ｃｘ４３羧基端包含多个结构域，且具??磷酸化位点。Ｃｘ４３可通过建立细胞间缝隙连接通讯２０?（ｇａｐ?ｊｕｎｃｔｉｏｎ??ｌｌｕｌａｒ?ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，?ＧＪＩＣ）发挥发挥通道依赖作用，例如在肝脏中，ＧＪＩＣ??蛋白分泌、Ｐ４５０同工酶形成和胆汁分泌等等，ＧＪＩＣ异常，会导致多种疾病??可不通过ＧＪＩＣ发挥非通道依赖的作用，如Ｃｘ４３可以通过参与ＥＲＫ１／２和??号通路促进肾系膜细胞增殖２２，参与调控Ｎｏｔｃｈ２３、ＮＦ－ｋＢ２４，?Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ２５??２６等多条信号通路。??前大部分研究支持Ｃｘ４３发挥肿瘤抑制作用２７＇２８。过表达Ｃｘ４３能够抑制肿??２９

（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）??Ａ?Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ?和?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ?蛋白检测电泳图??Ｂ为ＮＦｓ上清培养２ｄ时，半定量结果（＊户＜０．０５）??Ｃ为ＮＦｓ上清培养４ｄ时，半定量结果（＊Ｐ＜０．０５，?＊＊尸＜０．０１）??表５结直肠癌细胞经ＮＦｓ上清培养２ｄＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表??迗??检测蛋白?组别?（均数土标准差）“直?尸值??ＳＷ６２０?０．７９９±０．００６?０．３９２??Ｅ－ｃａｄｈｅｎｎ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．８０４±０．０４０?ｎｓ??ＳＷ６２０?０．８８０±０．０６８?１．１０５??Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．７６６±０．０３５?ｎｓ??ＳＷ６２０?０．３５４±０．０１１７?５．８０６??Ｖｉｍｅｎｔｍ?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?０．１７１±０．０３０?ｖｓ．ＳＷ６２０，?Ｐ＜０．０５??

Ａ?ＳＷ６２０细胞经ＮＦｓ上清条件培养２ｄ和４ｄ时，ｓ５５２和ＤＶＬ３蛋白表达下调（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）??Ｂ为ＮＦｓ上清培养２ｄ时，ＳＷ６２０细胞ｓ５５２和ＤＶＬ３半定量结果（ＭＹＣＯ．ＯＯＩ）??Ｃ为ＮＦｓ上清培养４ｄ时，ＳＷ６２０细胞ｓ５５２和ＤＶＬ３半定量结果（７Ｃ０．０５）??Ｄ?ＳＷ６２０细胞经ＮＦｓ上清条件培养２ｄ荧光素酶活性减弱（双荧光素酶报告基因活性检测）??（＊＊＊尸＜０＿００１?）??表７结直肠癌细胞经ＮＦｓ上清培养２ｄ?ｓ５５２和ＤＶＬ３蛋白表达??纟＾?（均?差）ｔｆｉ?Ｐｆｉ??ＳＷ６２０?０．９６５±０．０２０?２３．４３??ｓ５５２??ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?１．３００±０．００４?ｖ＾．ＳＷ６２０，?？＜０．００１??ＳＷ６２０?０．３６７士０．００８?２．５７５??ＤＶＬ３?ＳＷ６２０－ＮＦ－ＣＭ?１．０４５土０．０９８?ｎｓ??
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本文编号：2889677