AML外泌体miR-155对脑微血管内皮细胞紧密连接的影响及其机制的初步研究

发布时间：2020-11-21 10:32

　　 目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,AML患者长期生存率低,容易复发,复发的主要原因和化疗药物不易进入髓外浸润的白血病病灶有关。中枢神经系统是白血病髓外浸润的常见部位,血脑屏障是白血病细胞进行中枢神经系统浸润过程中必须穿过的结构,而脑微血管内皮细胞间的紧密连接是血脑屏障的主要组成成分。白血病细胞浸润中枢神经系统的机制目前尚不清楚。外泌体是细胞主动分泌的内含RNA、microRNA(miRNA或miR)等多种成分的囊泡结构,肿瘤细胞分泌的外泌体能与靶细胞融合,外泌体中的miRNA可调控靶细胞的基因表达。研究发现外泌体miRNA可促进肿瘤转移,脑部炎症时高表达的miR-155能破坏脑微血管内皮细胞间的紧密连接,增加血脑屏障的通透性。本课题组前期研究发现,miR-155在AML患者血浆外泌体中高表达,那么白血病细胞是否通过分泌外泌体与脑微血管内皮细胞融合,外泌体miR-155破坏内皮细胞间的紧密连接,从而导致白血病细胞浸润中枢神经系统?目前国内外尚未见这方面的报道。为此,本研究探讨AML细胞株HL-60来源的外泌体miR-155对脑微血管内皮细胞紧密连接的影响,并对其机制进行初步的研究,这对进一步阐明白血病细胞浸润中枢神经系统的分子机制,寻找新的抗浸润治疗的的分子靶标,研发新的有效治疗AML的方法,提高患者生存率具有十分重要和深远的意义。此外,还可为其它类型白血病细胞浸润中枢神经系统的分子机制和治疗的研究提供新的思路。方怯:1、外泌体的抽提和鉴定:利用Total Exosome Isolation Reagent外泌体提取试剂盒从AML细胞株HL-60和THP-1培养上清中分离外泌体。并通过透射电镜观察外泌体形态大小;ZETASIZERNano series-Nano-ZS仪器检测外泌体粒径大小;流式细胞仪分析外泌体表面标志性蛋白CD63和CD81的表达,对外泌体进行鉴定。2、AML细胞株及其来源的外泌体miR-155的表达分析:利用荧光定量PCR方法检测HL-60、THP-1细胞及其外泌体中miR-155的表达水平。3、慢病毒包装:通过酶切、转化、质粒抽提、质粒转染、浓缩纯化等方法构建并包装miR-155过表达和miR-155抑制表达慢病毒,并对病毒进行物理检测、无菌检测、滴度检测等质量检测。4、miR-155过表达和miR-155抑制表达HL-60细胞株的构建:miR-155过表达和miR-155抑制表达的慢病毒感染HL-60细胞株。5、miR-155过表达和miR-155抑制表达HL-60细胞株及其来源的外泌体中miR-155的表达分析:利用荧光定量PCR方法检测慢病毒感染后HL-60细胞以及其来源的外泌体中miR-155的表达水平。6、脑微血管内皮细胞摄取外泌体的分析:将从miR-155过表达、miR-155抑制表达的HL-60细胞株培养上清中提取的,并用CM-DIL标记的外泌体,与脑微血管内皮细胞HBMEC共培养后,用荧光显微镜观察细胞摄取外泌体。7、外泌体miR-155对内皮细胞跨膜阻抗及其紧密连接完整性影响的检测:用跨膜电阻仪和免疫荧光法分别检测内皮细胞跨膜阻抗值(TEER)和内皮细胞紧密连接的完整性。8、外泌体miR-155对内皮细胞ZO-1基因表达影响的检测:利用荧光定量PCR方法检测外泌体miR-155对内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1基因表达水平的影响。9、外泌体miR-155对内皮细胞ZO-1蛋白表达影响的检测:利用WestenBlot方法检测AML外泌体miR-155对内皮细胞紧密连接蛋白Z0-1蛋白表达水平的影响。结果:1、外泌体的特性:从白血病细胞株HL-60、THP-1培养液中均分离得到了大小较为均一的圆形、类圆形的囊泡状物质,直径在30-150nm之间,其包膜完整,边缘清晰,内有低电子密度小颗粒,标志性蛋白CD63和CD81阳性表达率分别为 86.1%和 92.1%。2、AML细胞株及其来源的外泌体miR-155的表达:通过荧光定量PCR方法检测发现,miR-155在HL-60和THP-1两种细胞及其来源的外泌体中均有表达,miR-155在HL-60细胞的表达是其在THP-1细胞中的表达的8.12倍,在HL-60细胞来源的外泌体中的表达是THP-1细胞来源的外泌体中的表达的6.73倍;差异具有统计学意义(P0.05)。3、miR-155过表达和miR-155抑制表达的HL-60细胞株及其来源外泌体中miR-155的表达:构建的miR-155过表达和miR-155抑制表达慢病毒,转染HL-60细胞株的转染率超过80%,与对照组相比,miR-155过表达细胞株及其来源的外泌体中miR-155的表达分别增高10.03倍和13.75倍,miR-155抑制表达细胞株及其来源的外泌体中miR-155的表达分别降低5.55倍和2.53倍;差异均具有统计学意义(P0.05)。4、脑微血管内皮细胞对外泌体的摄取:过表达miR-155和抑制表达miR-155的HL-60细胞株来源的外泌体和HBMEC共培养后,能被脑微血管内皮细胞摄取。5、外泌体miR-155对内皮细胞跨膜阻抗及其紧密连接完整性的影响:与对照组和抑制表达miR-155的外泌体相比较,过表达miR-155的外泌体显著降低脑微血管内皮细胞的跨膜阻抗值(P0.05),并破坏脑微血管内皮细胞间紧密连接的完整性。6、外泌体miR-155对内皮细胞紧密连接关键分子ZO-1基因和蛋白表达水平的影响:与对照组和抑制表达miR-155的外泌体相比较,过表达miR-155的外泌体显著抑制内皮细胞紧密连接关键分子ZO-1基因表达水平和蛋白表达水平(P0.05)。结论:1.AML外泌体miR-155进入血管内皮细胞。2.AML外泌体miR-155降低脑微血管内皮细胞电阻抗值,破坏紧密连接完整性。3.AML外泌体miR-155对紧密连接关键分子ZO-1具有负调控作用。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R733.71
【部分图文】：

要的结构蛋白、特异性酶、ｇａｇ和ｐｏｌ基因表达的调节因子。ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０载体中??携带有单纯疱瘆病毒来源的ＶＳＶ－Ｇ基因，可以为病毒包装提供所需要的包膜蛋??白。ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０和ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０病毒载体结构见图２。??ｙ?１?－??图１?ｍｉＲ－１５５过表达和抑制表达慢病毒载体结构图??Ａ：?ＧＶ３６９?为?ｍｉＲ－１５５?过表达慢病毒载体，原件顺序?Ｕｂｉ－ＭＣＳ－ＳＶ４０－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??Ｂ：?ＧＶ２３４为ｍｉＲ－１５５抑制表达慢病毒载体，原件顺序为ｈＵ６－ＭＣＳ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ??占Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?！?＼?〇／?Ｈｅｌｐｅｒ２．０?＼??／＼Ｕ３?Ｒ?昍??＇??图２?Ａ为Ｈｅｌｐｅｒ?１．０病毒载体，Ｂ为Ｈｅｌｐｅｒ?２．０病毒载体??载体酶切：??按照下表顺序依次加入各种试剂，配制反应体系将载体进行酶切。反应体系??配制完成后，用移液枪小心抽吸混匀，轻微离心，３７°Ｃ孵育过夜。将载体酶切??产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收其目的条带。??１４??

３．１．２外泌体的粒径大小??重悬后的外泌体样品，通过ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ?Ｎａｎｏ?ｓｅｒｉｅｓ－Ｎａｎｏ－ＺＳ仪器进行分析，??结果如图４所示，检测到的外泌体粒径主峰为６６．６３ｎｍ，平均粒径为３１．２５，其??中２０ｎｍ－２００ｎｍ范围７２．２％，平均粒径以及粒径主峰均与公认的外泌体粒径大小??吻合。且检测得到的粒子分布系数（ＰＤＩ）为０．４６２?（见表１），在０．０８－０．７之间，??证明体系分散度适中，检测结果置信度高。??Ｓｉｚｅ?Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｂｙ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ??８ｔ?？：?：?：?：?：??ｃ????ｉ．?ｊＢｋ?．ｉ????１?１０?１００?１０００?１００００??Ｓｉｚｅ?（ｄ．ｎｍ）??图４外泌体粒径分布图??纵坐标表示各种大小外泌体所占外泌体总数的百分比，单位为％；横坐标表示外泌体直径大??小，单位为ｎｍ。??表１：外泌体的粒径分布??样品?平均粒径?分布系数?粒径主峰?２０ｎｍ－２００ｎｍ??（ＰＤＩ）?＊?粒径百分比??外泌体?３１．２５ｎｍ?０．４６２?６６．６３ｎｍ?７２．２％??＊分布系数（ＰＤＩ），根据累积距法得到，是一个无量纲的值，代表粒子尺寸的分??布：０．０８－０．７代表适中分散度体系，是运算法则最佳适用范围。??２８??

３．０外泌体表面特异性膜蛋白??从急性髓白血病细胞株ＨＬ－６０培养上清液提取的外泌体，经流式细胞仪检??测，均表达ＣＤ６３、ＣＤ８１两个外泌体特异性分子标志物，结果如图５：阳性率分??别为８６．１％和９２．１％，进一步证明了该提取物为外泌体。??ＮＣ?Ｃ０６３?ＣＤ８１??Ｇａｔｅ：?ＰＩ?Ｇａｔｅ：?ＰＩ?Ｇａｔｅ：Ｐｌ??ｎ?ＴＴｒＩ?Ｉ?Ｖ３－Ｒ?：ＴＴｉ?ｖＴｆＴ??ＪＯ?２％?ｌ?９?８％?１３?Ｓ＇：４?８６?１９％?９２?１％??Ｉ?Ｓ－?Ｉ?Ｓ?Ｌ??Ｊ§－?■?Ｊ§－?■?Ｊ§．?Ｉ，??ｃ?ｉｉｕｉｉ＇?７?（ｉｉｉｉｉ?ｉ?：！■（?ｃ?十ＴｎｉｆＴＴＴｒｔｌ＾一Ｉ?ｌｌｔｌｉｌ?Ｉ?ｉｉ＇ｉ．１１?Ｉ?ｋｎ?ｔａ?ｎＴＷ＾Ｈｌ＾ｉＭｗｒ?ｍｉ?ｎ?ｉｉｉ?■??．１?＾?＾?＾?ＫＳ?Ｋｂ?ＷＴ２?？，?ｙ?ｄ?？５?＃?＊７２?＾?＾?＜３?＾?？”??ＦＬ１Ａ?ＦＬ１．Ａ?ＦＬ１－Ａ??图５外泌体特异性蛋白ＣＤ６３、ＣＤ８１的表达??纵坐标为外泌体阳性／阴性数目，横坐标为荧光检测强度，红色为标准线，标准线右侧为阳??性峰，蛋白ＣＤ６３表达阳性率为８６．１％，?ＣＤ８１表达阳性率为９２．１％。??３．２?ｍｉＲ－１５５在ＡＭＬ白血病细胞株中的表达水平??运用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法检测ｍｉｒ－１５５在急性髓系白血病细胞ＴＨＰ－１和ＨＬ－６０中??的表达情况。结果可见（图６），ｍｉＲ－１５５在ＴＨＰ－１和ＨＬ－６０两种细胞中均有所??表达。与ＴＨＰ－１细胞比较
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本文编号：2892879