HBV阳性肝癌组织中心体冗余的潜在机制及肝癌患者血清Cripto-1水平研究

发布时间：2020-11-21 16:32

　　 原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一个世界性的主要的健康问题,因乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的不断传播,其发生率在全球不断地升高。多数患者是由HBV或HCV感染后导致慢性肝炎或肝硬化和非病毒性因素包括酒精性及非酒精性脂肪肝发展而来。少部分患者是由黄曲霉素暴露和一些遗传因素导致。并且肝硬化的患者具有很高的肝癌发生危险。肝癌在早期阶段可以治愈,但发展到晚期治疗困难,并且患者的预后差。肝癌早期无明显特异性的症状,这为早期发现肝癌带来困难,因此探究可早期发现肝癌或可预测肝癌发生风险的肿瘤标志物具有十分重要的临床意义。第一部分:中心体(centrosome)是细胞内主要的微管组织中心,中心体复制调节异常会通过异常细胞分裂导致肿瘤发生和染色体错误分离。因此,准确地维持中心体数目对细胞的正常存活十分重要。阐明中心体的调控机制对了解中心体过度复制与肿瘤的因果关系十分必要,并可能因而发掘出更有效的抗肿瘤治疗方法。中心体数目增多即中心体扩增(centrosome amplification,CA)是中心体异常的主要表现形式,存在于多种人类肿瘤中。自噬(autophagy)是一个细胞内进化上保守的过程,细胞质和受损的细胞器等会被溶酶体内的水解酶通过此过程降解后完成能量的循环利用。在细胞遇到营养缺乏或一些其它的刺激时,自噬可为细胞提供存活的机制。近年来在自噬与肿瘤的研究方面有了很多进展,并且自噬缺陷与肿瘤的发生相关。有关肝癌内中心体的情况的研究甚少,本研究应用免疫荧光及免疫组织化学等多种实验方法探究肝癌组织内中心体及自噬的状况。共收集了21例正常肝脏组织,77例肝癌组织包括HBV阳性63例和HBV阴性14例。并利用肝癌细胞系初步探索异常中心体与自噬间的潜在关系。实验结果如下:人肝癌组织内中心体数目明显高于正常人肝脏组织内的中心体数目,而自噬缺陷标志物p62在肝癌组织内的表达比正常肝脏内高,并且HBV感染的肝癌组织内中心体数目与p62的表达呈正相关。但是肝癌组织内中心体数目在肿瘤组织病理学分级和TNM(Tumor Node Metastasis)分期中都没有显著的差异。分别观察了HepRG细胞、HepG2细胞、HepG2.2.15细胞内中心体的状态,发现除HepRG细胞内中心体正常外,HepG2细胞和HepG2.2.15细胞均存在异常中心体,主要表现为数目异常。HepG2细胞、HepG2.2.15细胞内转入LC3,并进一步p62荧光染色,含有HBV基因组的HepG2.2.15细胞内LC3及p62的荧光强度均明显高于HepG2细胞,即自噬的起始程度较高,但存在自噬缺陷,自噬过程不能完成。发现转染HBV或HBx的HepG2细胞可同时观察到中心体异常及p62高表达,并且多余的中心体与p62可共定位,说明至少部分多余的中心体是因HBV或HBx诱导的自噬缺陷而不能降解导致。同时给予一组HepG2细胞饥饿刺激诱导自噬起始,其中心体数目较正常HepG2细胞中少,可能原因是多余中心体被自噬途径降解来维持细胞存活。综上,这些结果表明肝组织内中心体异常增多可作为肝癌的肿瘤生物学标志物。HBV可诱导肝癌细胞自噬起始但自噬完成受阻,异常的中心体不能通过自噬过程清除,这可能是HBV相关性肝癌内存在中心体异常的潜在机制之一。第二部分:畸胎瘤衍生生长因子-1(Cripto-1,CR-1)是细胞膜锚定蛋白,在调节胚胎发育过程中具有重要作用,其在多种人类肿瘤的形成和进展中也起到重要角色,可刺激细胞增殖、上皮细胞向间充质细胞转化、迁移和肿瘤血管生成等。有研究证明,在胚胎发育期间的细胞发展调节和肿瘤形成过程中的细胞转化具有共同的信号通路,表明胚胎信号通路调节异常激活可能致使成年组织中细胞转化和肿瘤进展。据报道Cripto-1是有活性的膜相关共受体,并且Cripto-1的可溶性形式也在很多不同的体内和体外实验中证明其具有活性。很多肿瘤组织中检测到Cripto-1的表达较正常组织中升高,近年研究中发现在一些肿瘤患者的血浆或血清内,其表达水平也升高,但在肝病患者尤其是肝癌患者的血清中Cripto-1的表达情况尚不清楚。我们应用夹心酶联免疫吸附法(sandwich-type ELISA)检测330名包括肝癌、肝硬化、慢性肝炎的患者和明确没有HBV或HCV感染的50名正常志愿者血清中Cripto-1的水平。实验结果如下:肝癌患者血清Cripto-1的水平比正常对照组高,并且乙肝肝癌患者比丙肝肝癌患者高。另外,在乙肝肝癌患者血清中Cripto-1水平与甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)相关。肝硬化和慢性肝炎患者血清内Cripto-1的水平也高于志愿者对照。乙肝肝硬化患者血清Cripto-1水平比慢性乙型肝炎患者高,但在丙肝肝硬化和慢性丙型肝炎患者中无此差异。总之,肝癌患者血清Cripto-1水平升高,但其诊断乙肝相关性肝癌的敏感性较低,仅可作为临床上诊断乙肝相关性肝癌的补充生物学标志物。乙肝相关性肝脏疾病患者血清内的高水平Cripto-1可能部分源于HBV感染。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

在正常细胞中，复制后的中心体移动到细胞的两个有丝分裂纺锤体极。这个过程保证有丝分裂期染色体是动物细胞中主要的微管组织中心（microtubule-or此它在细胞间期调节细胞运动性、黏附力和极性，并极的形成。多种肿瘤中存在纺锤体极组织功能异常，可[36]，因为多余且常为异常的中心体可导致细胞分裂异陷的中心体常在肿瘤中发现，报道最多的中心体异常中心体扩增（centrosome amplification, CA）[38]。染色基因的激活和肿瘤抑制基因的失控，这些都涉及到肿不均衡也涉及到肿瘤进展和发展为肿瘤转移的潜在可体的核心组成部分，有另一个独特的功能是作为基体，纤毛和鞭毛在生理、发育和疾病中有关键的作用。的严格控制对机体健康十分重要。

[39]。染色体不稳定性的潜在机制仍不清楚，但可能包括染色体凝聚力、有丝分检查点功能、中心体复制数目、着丝点微管附着力和细胞周期调节缺陷[40]。之前人们就猜测中心体扩增和人类肿瘤发展之间的因果关系[41]，然而这个猜测的证仍未完全证实。中心体扩增存在于多种肿瘤中，包括实体肿瘤和血液肿瘤，并及到多极有丝分裂、染色体不稳定性和非整倍体的主要产生机制。存在两个中体的细胞可形成双极纺锤体，染色体可正常分离，细胞可以保持增殖。细胞进有丝分裂时具有超过两个中心体也可进入多极有丝分裂或中心体聚集后任然成双极纺锤体。多极分裂后的细胞为非整倍体，通常不能生存而少见。而聚集中心体会导致滞后染色体产生，如图 1.2[42]。已知多个致癌基因和肿瘤抑制蛋定位于中心体，它们的异常调节可能导致中心体异常[43]。一些新的研究表明在些癌前病变中可检测到中心体缺陷，同时也发现中心体变异增多与疾病进展关。此外，它与染色体组型大量变异和患者预后差相关，支持其在人类肿瘤中重要临床意义。

图 1.3 自噬过程的描述Figure 1.3 Depiction of the process of autophagy1.3.3 自噬控制蛋白质质量自噬通过其基本的活动降解过多或受损的蛋白质和细胞器，这对维持细胞稳态和功能具有关键作用。尤其对分裂后的不能通过细胞分裂稀释细胞内废弃产物的细胞更为重要。自噬受损的小鼠会导致休眠细胞如神经元和肝细胞堆积泛素和p62 标记的蛋白内容物、异常膜结构和畸形的线粒体，伴随着神经元退化和肝损伤[92; 93]。泛素和 p62 标记的内容物已被证实与多种肝脏疾病有关，包括肝炎和原发性肝癌[94]。P62 积累会造成肝毒性，因为在自噬缺陷的小鼠细胞内敲除 p62 基因会起到部分抑制蛋白内容物的形成和肝损伤[95]。遗传受损是否是一些人类肝脏疾病的病因以及刺激自噬是否会延缓疾病进展十分值得探究。
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本文编号：2893287