异构酶Pin1对瑞戈非尼耐药前后肝癌细胞侵袭转移的影响及机制研究

发布时间：2020-11-21 14:50

　　 目的:肝癌是全球发病率位居第六的癌症,但目前已成为癌症致死的第二大因素。今一线靶向药Sorafenib,已出现耐药及肝癌转移复发,然而新被批准的二线治疗药物瑞戈非尼(Regorafenib)是否会发生耐药及耐药后的相关机制均不清楚。我们此前的研究表明,脯氨酰顺反异构酶Pin1在肝癌的发生发展中发挥着重要作用。因此,本文重点考察在肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后,Pin1对侵袭转移的影响,并从EMT的角度探讨其相关机制,以发现潜在缓解肝癌瑞戈非尼耐药的策略。方法:(1)Western Blot及免疫荧光实验检测肝癌临床标本中Pin1及EMT相关蛋白表达的关系。(2)五质粒系统包装Pin1敲减或过表达的慢病毒,感染MHCC-97H、Huh7、THLE3细胞,筛选建立稳定敲减或过表达Pin1的肝癌细胞株。(3)以SMMC-7721肝癌细胞为研究对象,采用Regorafenib药物低浓度(0.5μM)开始,梯度间歇诱导的方法,筛选出瑞戈非尼耐药株SMMC-7721-R-R;计算出相应的耐药指数(resistance index,RI=耐药细胞的IC50/亲代细胞的IC50)。(4)相差显微镜观察并拍照收集肝癌细胞耐药前后及Pin1敲减前后细胞形态的改变。(5)观察Pin1敲减或过表达对MHCC-97H、Huh7、THLE3、SMMC-7721-R-R细胞株生物学行为的影响:生长曲线及平板克隆实验检测Pin1敲减或过表达对细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验及划痕实验检测Pin1敲减或过表达对细胞迁移侵袭能力的影响;(6)Western Blot及免疫荧光实验检测Pin1敲减对EMT相关蛋白、干性相关蛋白及Gli1通路蛋白表达影响。(7)构建裸鼠尾静脉注射肺转移模型,HE染色及免疫荧光检测Pin1敲减对肝癌细胞体内转移的影响。(8)干细胞培养条件,检测SMMC-7721细胞瑞戈非尼耐药前后,Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA对肝癌细胞成球能力的影响。结果:(1)肝癌临床标本中,Pin1表达与EMT相关蛋白表达水平具有一定关系。(2)成功构建了稳定敲减Pin1的肝癌细胞株,Huh7细胞中Pin1下调88%,MHCC-97H细胞中Pin1下调76%。(3)成功构建SMMC-7721瑞戈非尼耐药细胞株SMMC-7721-R-R,RI=1.53,为低度耐药。(4)Pin1敲减后细胞发生了明显的MET表型变化,表现为细胞极性的回复,细胞由不规则的形态变为排列整齐,形态规则的铺路石状细胞。(5)Pin1敲减或ATRA作用后,细胞增殖及克隆形成能力显著受到抑制(P0.001);Transwell小室及划痕实验表明,Pin1敲减使细胞迁移侵袭能力明显减弱(P0.001)。(6)Western Blot及免疫荧光结果显示Pin1敲减后,Pin1表达显著下调,上皮标记物E-cadherin表达显著上调,间质标志物Vimentin表达显著下调,转录因子Snail显著下调,Gli1显著下调。瑞戈非尼耐药株中干性相关基因Bmi1显著下调。(7)Pin1敲减有效减弱了细胞在裸鼠体内的转移能力(P0.001)。(8)肝癌细胞株瑞戈非尼耐药后,细胞成球能力明显增强,干性增加;Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA作用后,肝癌细胞瑞戈非尼耐药株干性相关蛋白的表达减少,成球能力明显受到抑制。结论:(1)肝癌细胞瑞戈非尼耐药后细胞迁移侵袭及体内转移能力显著增加,Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA可有效抑制肝癌细胞的增殖及瑞戈非尼耐药前后肝癌细胞的迁移侵袭及体内转移能力。(2)Pin1可能通过Gli1控制EMT相关蛋白的表达进而调控肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后的迁移侵袭及体内转移能力。(3)Pin1敲减及Pin1抑制剂ATRA能明显抑制肝癌细胞瑞戈非尼耐药后的干细胞成球能力。Pin1在肝癌细胞瑞戈非尼耐药前后的调节作用为临床指导瑞戈非尼用药及抑制肝癌瑞戈非尼耐药后的转移复发提供了有效的临床指导,对于肝癌的治疗具有指导意义。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

1.肝癌临床样本中，Pin1 蛋白表达与 EMT 相关蛋白表达相关肿瘤的转移与肿瘤细胞的迁移侵袭能力具有密切的相关性，研究表明当肿瘤细胞经历上皮间质转化（EMT）过程后，会增加细胞的迁移侵袭能力，进而促进肿瘤细胞在体内的转移能力。Pin1 在大多数肝癌细胞中处于高表达状态。为了检测肝癌临床样本中 Pin1 与EMT 相关蛋白表达水平的关系，我们对肝癌临床样本进行蛋白提取以及 OCT 包埋后制作冰冻切片，采用 Western Blot 及免疫荧光实验来评估肝癌临床样本中 Pin1表达与 EMT 相关蛋白表达的关系。发现 Pin1 在肝癌临床样本中表达有高低之分，Pin1 高表达的样本，转录因子 Snail 表达增加，E-cadherin 表达明显下调，相反，Pin1 低表达的样本中，Snail 表达减少，E-cadherin 表达明显上调。说明肝癌临床样本中，Snail 蛋白的表达随着 Pin1 表达的增加而增加，E-cadherin 的表达随着 Pin1表达的增加而减少。（图 1.1）

2. Pin1 敲减对肝癌细胞增殖及迁移侵袭能力的影响研究表明，在肝癌中 Pin1 表达与不良预后有关，Pin1 高表达促进肿瘤的浸润转移。研究发现在正常的人类乳腺癌上皮细胞 HMLE 中过表达 Pin1 可诱导细胞上皮间质转化（EMT），EMT 与肿瘤侵袭转移有关。肝癌临床标本中，Pin1 表达具有 EMT 特性，所以我们假设：肝癌细胞中，Pin1 可使肝癌细胞发生上皮间质转化进而调控肝癌细胞的迁移侵袭。2.1 Pin1 敲减后细胞表型及蛋白表达变化相差显微镜观察 Huh7、MHCC-97H 细胞感染 Pin1 敲减的慢病毒后，细胞触角及突出逐渐缩回，变为周边光滑，排列整齐的细胞，细胞形态向着上皮形态发展。（图 2.1）Pin1 敲减后，Western Blot 检测 Pin1 敲减效果，Huh7 细胞中 Pin1下调 88%，MHCC-97H 细胞中 Pin1 下调 76%。（图 2.1）

图 2.3 Pin1 敲减抑制肝癌细胞迁移侵袭能力（A、B）Huh7 及 MHCC-97H 细胞，0 h 及 72 h 划痕实验采集同一点，迁移面积。（P<0.001，Bar=100μm）（C、D）Huh7 及 MHCC-97H 细胞,Transwell 小室实验检测 72 h，肝癌细侵袭能力。（P<0.001， Bar=100μm）3. Pin1 过表达对肝细胞增殖及迁移侵袭能力的影响通过上述研究，我们发现，Pin1 能促进肝癌细胞的增殖及迁移侵袭了再次验证 Pin1 对细胞增殖及迁移侵袭能力的影响，我们在正常肝细胞Pin1 过表达及空载对照细胞，检测 Pin1 过表达对肝细胞增殖及迁移能力3.1 Pin1 过表达促进了肝细胞的增殖能力我们在正常肝细胞中构建了 Pin1 过表达及空载对照细胞，相差显微
【参考文献】

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本文编号：2893165