云南宣威肺癌circRNAs标志物的初步筛选及表达验证

发布时间：2020-11-22 03:01

　　 [目的]肺癌,作为全世界,尤其是亚洲地区最为常见的恶性肿瘤,其发病率、死亡率均居高不下。宣威肺癌(Lung cancer in Xuanwei,LCXW)是位于云南省东北部地区人群易发的一种肺癌,该地区的肺癌发病率和死亡率均高于全国平均水平,并呈不断上升趋势。由于缺乏敏感的检测标志物及有效的治疗方式,大多数宣威肺癌患者在出现症状前往医院就诊时,已处于癌症晚期阶段,因此丧失了最佳的治疗机会,给患者生理、心理均造成严重的打击。因此,寻找针对宣威肺癌的有效标志物,对早期诊断宣威肺癌具有重大意义。CircRNA以其具有稳定性,时间、组织表达特异性等特点,更适于反映疾病的发展阶段。本课题组应用circRNAs芯片对宣威肺癌组织中差异表达的circRNAs进行筛选,再进一步采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)对芯片中差异表达的circRNA进一步验证,以期初步筛选出可作为诊断宣威肺癌的潜在标志物。[方法]1.将26对宣威肺癌样本分别提取RNA后,按照分期(Ⅰ期:10/26;Ⅱ期:9/26;Ⅲ期:7/26)及组织来源(癌和癌旁)分为6组,每组内各样本混合后利用Arraystar Human circRNA Array V2分析circRNAs表达情况。采用箱图、火山图等方法,建立宣威地区肺癌相关circRNAs差异表达谱,Fold Change≥2认为差异是有统计学意义的,并通过生物信息学分析方法预测circRNAs的下游靶miRNA。2.对差异表达的circRNAs进行分析筛选,具体包括:①Fold Change越大越好;②每个样本的 Raw Intensity≥200;③CircRNAs 长度在 200-2000bp;④P-value越小越好;⑤现有研究已证实预测靶miRNAs或宿主基因与癌症有关的circRNAs。3.设计引物,采用RT-qPCR的方法,在50对宣威肺癌中进行候选circRNAs的表达验证。4.对患者的临床病例资料进行统计分析,运用统计学方法研究宣威肺癌患者候选circRNA的表达是否具有显著差异,采用Kaplan-Meier生存分析法评估circRNA的表达与宣威肺癌预后的关系,并分析差异表达的circRNAs与患者性别、年龄、吸烟史、病理分期、淋巴结转移情况以及肿瘤大小的相关性。[结果]1.通过circRNAs芯片技术发现:宣威肺癌中存在大量差异表达的circRNAs,其中Ⅰ期差异表达的circRNAs,上调的有717个,下调的有1055个;Ⅱ期差异表达的circRNAs,上调的有612个,下调的有806个;Ⅲ期差异表达的circRNAs,上调的有183个,下调的有455个;在3个时期中均出现差异表达的circRNAs共有537个,其中143个上调,394个下调,每个circRNA预测出5个可能结合的 miRNA。2.通过对差异表达的circRNAs筛选,再结合文献查阅其预测的下游靶miRNA功能,筛选出8个有价值的circRNAs进行后续研究。3.根据circRNAs的结构设计引物,并进行引物条件摸索,仅4个筛选出的circRNAs 的引物设计成功(hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_069397、hsa_circRNA_105013、hsa_circRNA_406010),采用 RT-qPCR 的方法,对这 4 个circRNA进行组织水平的表达验证。发现hsa_circRNA_104600(显著上调)、hsa_circRNA_105013(显著上调)、hsa_circRNA_406010(显著下调)在 50 对宣威肺癌组织中表达出现显著差异,其中hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_406010的组织验证结果与芯片结果一致,而hsa_circRNA_105013的组织验证结果与芯片结果不一致。4.采用统计学的方法对患者的临床病例资料进行分析,发现hsa_circRNA_104600、hsa_circRNA_105013的上调均与肿瘤大小有相关性。hsa_circRNA_406010下调的宣威肺癌患者预后较差。[结论]1.通过circRNAs芯片发现在宣威肺癌癌组织和癌旁组织中存在大量差异表达的 circRNAs。2.通过 RT-qPCR 显示 hsa_circrna_104600、hsa_circrna_105013 和hsa_circrna_406010 在宣威肺癌中异常表达,hsa_circrna_104600 和hsa_circrna_105013的表达差异水平与肿瘤大小具有相关性,而hsa_circrna_406010的表达差异水平与宣威肺癌患者预后相关。提示hsa_circrna_104600、hsa_circrna_105013 和 hsa_circrna_406010 可能成为诊断宣威肺癌的潜在的生物标志物。3.本研究为宣威肺癌发病机制研究、诊治及预后评估提供了新的研究数据。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

?４０?４４８０３．２?Ｐａｓｓ??２．２总ＲＮＡ跑胶图见图１－１，可见有２８ｓ、１８ｓ及５ｓ条带，表明所提取的ＲＮＡ较??为完整，可以认为样本ＲＮＡ没有降解，样本合格，可用于后续实验。??１８ｓ?Ｉ?１?％?－；：?Ｍ??５ｓ?Ｉ?

图１－２箱图??

３芯片结果分析??３．１?６组样本芯片扫描后的分析??箱图（图１－２）表明６组样本检测结果有良好的均一性：火山图（图１－３，由??差异倍数和Ｐ值所得，垂直线相当于宣威地区肺癌癌组织相较于癌旁组织的２??倍上调或下调，水平线代表尸值，图中的红点代表显著差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ，??显示Ａ与Ｐ存在显著差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ。??１８?｜?，?，?，?，???１６?！?？?ｉ??①??２?１４?－?－??１２?－
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本文编号：2894002