炎性小体NLRP6调控P53抑制结直肠癌的机制研究

发布时间：2020-12-02 21:47

　　目的:研究炎性小体NLRP6与P53在结直肠癌中的关系。方法:对结直肠癌细胞株HCT116 P53 WT（WT）和HCT116 P53-/-（KO）中的基因NLRP6进行干扰,构建NLRP6-ShRNA稳定细胞株;通过Real-TimePCR以及Western Blot验证NLRP6敲减效率;CCK-8以及Transwell测定成功构建的NLRP6-ShRNA稳定细胞株的增殖迁移能力;细胞免疫荧光实验测定NLRP6在细胞中的表达情况;流式细胞术测定NLRP6对细胞凋亡的影响;通过Western Blot 实验检测 NF-κB、MDM2、P53、P21WAF1/CIP1以及 CyclinB1 蛋白水平。结果:成功构建稳定细胞株WT CTRL、WT NLRP6-ShRNA、KO CTRL和KO NLRP6-ShRNA。NLRP6敲减效率在基因水平和蛋白水平都超过70%。在WT和KO细胞中敲减NLRP6都促进了细胞的增殖和迁移;而且KO NLRP6-ShRNA的增殖迁移比WT NLRP6-ShRNA明显。通过细胞免疫荧光实验我们发现NLRP6在胞浆表达。敲减NLRP6后,结直肠癌细胞凋亡减少... 

【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

人类NOD样受体家族蛋白结构和分类〔叨

程是装配ＮＬＲＰ３，ＡＳＣ以及Ｃａｓｐａｓｅ－１前体形成一＂复合物。这促使Ｃａｓｐａｓｅ－１??前体转变成Ｃａｓｐａｓｅ－１，同时也分泌ＩＬ－１８和ＩＬ－１Ｐ［４４＿４６］。目前，有三个模型来??描述炎性小体激活第二步（图１．２）?［２５］。然而，所有模型都证明ＮＬＲＰ３不直接??与外源性激动剂反应，而是通过ＮＬＲＰ３感知大部分的病原体。第一个模型中，??细胞外的ＡＴＰ?（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ?ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ），作为ＮＬＲＰ３的激动剂，通过Ｐ２Ｘ７依??赖ＰＡＮＸ－１?（Ｐａｎｎｅｘｉｎ－１）通道诱导钾离子外流；从而，激活和组装炎性小体??ＮＬＲＰ３。与此模型一致，钾离子外流是炎性小体ＮＬＲＰ３主要的激动剂，而胞外??４??

确定目的基因ＮＬＲＰ６蛋白表达水平。我们进一步推进实验，构建好的结??直肠癌细胞系?ＷＴ?ＣＴＲＬ?与?ＷＴ?ＮＬＲＰ６＿ＳｈＲＮＡ?以及?Ｋ０?ＣＴＲＬ?与?ＫＯ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ，??培养至细胞生长对数期，提取蛋白，变性，蛋白定量。结果图３．３所示，??＾?＃??＾?１?＇??ｓ?ｉ?ｉ?彦??＾?＃?＃?＃??ＮＬＲＰ６?＼ｍｍｕｍｍｍ??（３－ａｃｔｉｎ?＿ｍｎｍｈｈｈ??图３．?３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ检测结直肠癌细胞系敲减ＮＬＲＰ６的表达情况??我们使用３－ａｃｔｉｎ管家基因作为内部参照，管家基因在细胞中恒定表达，??基本不受到任何分子干扰。上述ＷＴ?ＣＴＲＬ，ＷＴ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ，ＫＯ?ＣＴＲＬ和Ｋ０??ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ四株细胞，３－ａｃｔｉｎ的表达量基本相同，说明每个细胞株的总蛋??白一致；同时，在ＷＴ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ和ＫＯ?ＮＬＲＰ６－ＳｈＲＮＡ中，ＮＬＲＰ６的表达水平??３７??

【参考文献】：
期刊论文
[1]上海市2003～2007年大肠癌发病率和死亡率分析[J]. 李德錄,吴春晓,郑莹,仲伟鉴,吴凡.  中国肿瘤. 2011(06)



本文编号：2895635