PI3K/AKT/FOXO1信号通路参与复方中药CFF-1诱导的前列腺癌细胞凋亡和周期阻滞
发布时间：2020-12-08 01:15
目的:研究复方中药CFF-1诱导前列腺癌细胞的凋亡作用及其相关分子机制的探讨。方法:通过形态学观察、噻唑蓝（MTT）比色实验、CCK-8实验测定前列腺癌细胞的存活能力;采用DAPI染色法测定细胞核凝缩破裂;运用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定前列腺癌细胞的凋亡率。再通过PI单染流式细胞术测定前列腺癌细胞的周期变化;以及采用蛋白质免疫印迹实验检测PI3K/AKT/FOXO1信号通路以及其下游凋亡相关蛋白和周期相关蛋白的表达。结果:复方中药CFF-1使前列腺癌细胞周期阻滞在G1期,并呈浓度依赖性降低细胞的存活能力、增加细胞核凝缩破裂以及核小体的形成,显著提高前列腺癌细胞的凋亡率。在分子机制上,CFF-1呈现浓度依赖性下调PI3K/AKT活性,降低FOXO1磷酸化水平,进而上调FOXO1的转录活性,最终影响凋亡相关基因和周期相关基因的表达。结论:CFF-1对前列腺癌细胞的生长有显著的抑制作用,并且通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路诱导前列腺癌细胞周期阻滞并发生凋亡,对治疗前列腺癌具有潜在的临床应用价值。
【文章来源】：中华男科学杂志. 2017年09期 第828-837页 北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
CFF-1对前列腺组织细胞的形态及存活的影响
ず突钚缘姆肿踊?蒲芯俊?2．2CFF-1对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响不同浓度CFF-1处理LNCaP和PC3细胞后，采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果如图2A所示，无论是LNCaP还是PC3细胞，用CFF-1处理后，细胞均发生凋亡，而且细胞凋亡率都随着CFF-1的浓度增加而显著增加。同样，不同浓度的CFF-1处理过的LNCaP和PC3细胞进行DAPI染色分析细胞核凝缩破裂情况时，也发现:CFF-1的处理促进细胞核的凝缩、破裂和凋亡小体的形成，并且随着CFF-1浓度的增加，细胞核凝缩、破裂和核小体形成的情况也显著增多(如图2C所示)。此外，采用PI单染流式细胞术检测细胞周期变化，结果如图2B所示，CFF-1处理LNCaP和PC3细胞后，处于G1期细胞数量明显增加，而且，随着CFF-1浓度增加，G1期细胞数也明显增加，说明:CFF-1处理细胞后，细胞周期主要阻滞在G1期。以上实验结果表明CFF-1能够促进前列腺癌细胞发生凋亡和诱导细胞周期阻滞。图2CFF-1对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响(A)LNCaP和PC3细胞分别用不同浓度CFF-1处理后，用Annexin-V-FITC/PI双染，在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况;(B)LNCaP和PC3细胞分别用不同浓度CFF-1处理后，用PI单染，在流式细胞仪上分析细胞周期;(C)不同浓度CFF-1处理细胞24h后，用DAPI染色在荧光显微镜下观察细胞核的聚缩破裂情况Figure2．EffectsofCFF-1ontheapoptosisandcellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsA:ApoptosisoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyAnnexin-V-FITC/PIdoublestainingandflowcytometry;B:cellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyPIstainingan
AKT信号通路的直接下游靶分子，并且FOXO1在前列腺癌细胞中扮演重要角色。因此，我们检测了PI3K/AKT下游FOXO1(Ser256位点)的磷酸化水平，结果如图3C和3D所示:CFF-1处理细胞后，无论是LNCaP细胞还是PC3细胞，其FOXO1(Ser256)的磷酸化受到明显抑制，磷酸化水平明显下降;而且其受抑制程度也随着CFF-1浓度的增加而显著增加，但FOXO1总蛋白水平不受CFF-1的影响。以上结果表明CFF-1抑制PI3K/AKT信号通路的活性，降低FOXO1Ser256的磷酸化水平，进而激活FOXO1的转录活性。图3CFF-1调节PI3K/AKT/FOXO1信号通路活性(A)和(B)Western印迹分析不同浓度CFF-1处理过的LNCaP或PC3细胞中总的PI3K、AKT及其磷酸化水平的变化;(C)和(D)Western-blot分析不同浓度CFF-1处理过的LNCaP或PC3细胞中总的FOXO1及其磷酸化水平的变化Figure3．ＲegulatoryeffectofCFF-1ontheactivityofthePI3K/AKT/FOXO1signalingpathwayintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsAandB:LevelsofPI3K，AKTandtheirphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot;CandD:levelsofFOXO1anditsphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot．2．4CFF-1通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路诱导前列腺癌细胞发生线粒体依赖和非依赖的细胞凋亡我们知道，FOXO1Ser256位点的磷酸化水平降低，意味着可以进入细胞核发挥转录活性的FOXO1分子数就增加，其下游与细胞生长和细胞凋亡相关的一系列基因的表达就会受到影响，并诱导细胞发生外在途径和线粒体途径的细胞凋亡［10］。由图3可知，PI3K/AKT信号通路活性下降、FOXO1Ser25
本文编号：2904195
【文章来源】：中华男科学杂志. 2017年09期 第828-837页 北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
CFF-1对前列腺组织细胞的形态及存活的影响
ず突钚缘姆肿踊?蒲芯俊?2．2CFF-1对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响不同浓度CFF-1处理LNCaP和PC3细胞后，采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果如图2A所示，无论是LNCaP还是PC3细胞，用CFF-1处理后，细胞均发生凋亡，而且细胞凋亡率都随着CFF-1的浓度增加而显著增加。同样，不同浓度的CFF-1处理过的LNCaP和PC3细胞进行DAPI染色分析细胞核凝缩破裂情况时，也发现:CFF-1的处理促进细胞核的凝缩、破裂和凋亡小体的形成，并且随着CFF-1浓度的增加，细胞核凝缩、破裂和核小体形成的情况也显著增多(如图2C所示)。此外，采用PI单染流式细胞术检测细胞周期变化，结果如图2B所示，CFF-1处理LNCaP和PC3细胞后，处于G1期细胞数量明显增加，而且，随着CFF-1浓度增加，G1期细胞数也明显增加，说明:CFF-1处理细胞后，细胞周期主要阻滞在G1期。以上实验结果表明CFF-1能够促进前列腺癌细胞发生凋亡和诱导细胞周期阻滞。图2CFF-1对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响(A)LNCaP和PC3细胞分别用不同浓度CFF-1处理后，用Annexin-V-FITC/PI双染，在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况;(B)LNCaP和PC3细胞分别用不同浓度CFF-1处理后，用PI单染，在流式细胞仪上分析细胞周期;(C)不同浓度CFF-1处理细胞24h后，用DAPI染色在荧光显微镜下观察细胞核的聚缩破裂情况Figure2．EffectsofCFF-1ontheapoptosisandcellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsA:ApoptosisoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyAnnexin-V-FITC/PIdoublestainingandflowcytometry;B:cellcycleoftheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyPIstainingan
AKT信号通路的直接下游靶分子，并且FOXO1在前列腺癌细胞中扮演重要角色。因此，我们检测了PI3K/AKT下游FOXO1(Ser256位点)的磷酸化水平，结果如图3C和3D所示:CFF-1处理细胞后，无论是LNCaP细胞还是PC3细胞，其FOXO1(Ser256)的磷酸化受到明显抑制，磷酸化水平明显下降;而且其受抑制程度也随着CFF-1浓度的增加而显著增加，但FOXO1总蛋白水平不受CFF-1的影响。以上结果表明CFF-1抑制PI3K/AKT信号通路的活性，降低FOXO1Ser256的磷酸化水平，进而激活FOXO1的转录活性。图3CFF-1调节PI3K/AKT/FOXO1信号通路活性(A)和(B)Western印迹分析不同浓度CFF-1处理过的LNCaP或PC3细胞中总的PI3K、AKT及其磷酸化水平的变化;(C)和(D)Western-blot分析不同浓度CFF-1处理过的LNCaP或PC3细胞中总的FOXO1及其磷酸化水平的变化Figure3．ＲegulatoryeffectofCFF-1ontheactivityofthePI3K/AKT/FOXO1signalingpathwayintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsAandB:LevelsofPI3K，AKTandtheirphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot;CandD:levelsofFOXO1anditsphosphorylationintheprostatecancerLNCaPandPC3cellsaftertreatedwithCFF-1at0，2，5，or10mg/mlfor24hoursdeterminedbyWesternblot．2．4CFF-1通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路诱导前列腺癌细胞发生线粒体依赖和非依赖的细胞凋亡我们知道，FOXO1Ser256位点的磷酸化水平降低，意味着可以进入细胞核发挥转录活性的FOXO1分子数就增加，其下游与细胞生长和细胞凋亡相关的一系列基因的表达就会受到影响，并诱导细胞发生外在途径和线粒体途径的细胞凋亡［10］。由图3可知，PI3K/AKT信号通路活性下降、FOXO1Ser25
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