融合蛋白PTEN-L-p53抑制U251细胞的增殖与转移
发布时间：2021-03-18 18:38
PTEN是一个常见的肿瘤抑制因子,其磷酸酶活性能够对PIP3进行去磷酸化以抑制AKT的活性。PTEN-Long（PTEN-L）是PTEN的一个亚型,国内外多数文献报道其N端173个氨基酸（PTEN-L leader）具有潜在的分泌信号。与经典的PTEN不同的是,PTEN-L不仅能够从细胞中分泌出来,还能再次进入其它细胞内发挥PTEN蛋白的生物学活性。该特点可以应用于蛋白治疗临床疾病以代替传统的DNA或者RNA载体运输外源性基因进行基因治疗。在该研究中,我们将PTEN-L leader与另一个肿瘤抑制因子TP53嵌合,经过转录翻译后形成融合蛋白PTEN-L-p53。我们在已过表达PTEN-L-p53的HEK293T细胞的培养基中检测到该融合蛋白的存在,因此,PTEN-L-p53能够像PTEN-L一样从细胞内分泌出来。利用PTEN-L-p53的分泌性,我们采用超滤管对含有融合蛋白的培养基进行超滤浓缩（CFPCM）,然后把CFPCM加入U251细胞(TP53R273H,p53突变)中,进而显著地抑制了该细胞的活性。由于PTEN-L-p53基因中包含的PTEN-L lea...
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
融合PTEN-Lleader与TP53获得PTEN-L-p53
图 4.2 构建 pSecTag2 A-PTEN-L-p53 质粒。（A）酶切鉴定 pSecTag2 A- PTEN-L-p53 质粒，在 1800 bp 附近出现 PTEN-L-P53 条带；1 和 2，pSecTag2 A-PTEN-L-p53 质粒，两个生物学重复；3 和 4，pSecTag2 A 空载体，两个生物学重复；M，DNA ladder。(B)正向测序结果显示 PTEN-L leader 序列全部正确。(C)正向测序结果显示 TP53 序列中第 2个密码子发生了同义突变，谷氨酸 GAG 突变成了 GAA。4.3 构建 pcDNA3.1-TP53 质粒通过 PCR 技术获得 TP53（图 4.3A）后，其上游酶切位点为 HindIII，下游酶切位点为 xhoI，然后将其连接到 pcDNA3.1（+）表达载体上，使用 TAKARA 公司的 HindIII及 xhoI 快切酶对该质粒进行酶切鉴定，结果显示正确（图 4.3B）。酶切鉴定后，将正确的质粒送生工测序公司测序 TP53 的正向测序结果显示基因序列发现第 6 个碱基 G 突变成 A, 即谷氨酸 GAG 突变成 GAA，视为氨基酸发生同义突变（图 4.3C）。因突变并不会影响氨基酸的特性，则将继续使用该基因进行特性及功能探讨。
图 4.3 构建 pcDNA3.1-TP53 质粒。（A）PCR 扩增 TP53 基因，在 1200 bp 左右出现 TP5基因的条带；1 和 2，两个生物学重复。(B) 酶切鉴定 pcDNA3.1-TP53 质粒，在 2000 b附近出现 PTEN-L-P53 条带；1，pcDNA3.1（+）空载体；2，3，4 和 5，pcDNA3.1-TP5质粒，四个生物学重复。（C）正向测序结果显示 TP53 序列中第 2 个密码子发生了同义突变，谷氨酸 GAG 突变成了 GAA。4.4 PTEN-L-p53 在 HEK293T 细胞中过表达PTEN-L leader 也许能够作为一个安全有效的载体将 p53 直接传送至靶细胞从而发挥 p53 的生物学功能。我们将 PTEN-L leader 与野生型 TP53 基因通过 PCR 技术进行融合，形成融合基因 PTEN-L-p53。PTEN-L-p53 基因连接到 pSecTag2 A 载体上，该载体上含有翻译起始密码子 ATG，因此，我们在设计引物时并没有修改 PTEN-Lleader 的起始密码子 CTG。除此以外，pSecTag2 A 载体中包含一个鼠源的 Ig 信号肽 (ISP)，连入PTEN-L-p53 后，加在融合基因的 N 端，能够促进该融合蛋白的分泌。pSecTag2A 中还
【参考文献】：
期刊论文
[1]A PTEN translational isoform has PTEN-like activity[J]. Xie Zhang,Bowei Yin,Fangfang Zhu,Guochang Huang,Hong Li. Chinese Journal of Cancer Research. 2015(05)
本文编号：3088746
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
融合PTEN-Lleader与TP53获得PTEN-L-p53
图 4.2 构建 pSecTag2 A-PTEN-L-p53 质粒。（A）酶切鉴定 pSecTag2 A- PTEN-L-p53 质粒，在 1800 bp 附近出现 PTEN-L-P53 条带；1 和 2，pSecTag2 A-PTEN-L-p53 质粒，两个生物学重复；3 和 4，pSecTag2 A 空载体，两个生物学重复；M，DNA ladder。(B)正向测序结果显示 PTEN-L leader 序列全部正确。(C)正向测序结果显示 TP53 序列中第 2个密码子发生了同义突变，谷氨酸 GAG 突变成了 GAA。4.3 构建 pcDNA3.1-TP53 质粒通过 PCR 技术获得 TP53（图 4.3A）后，其上游酶切位点为 HindIII，下游酶切位点为 xhoI，然后将其连接到 pcDNA3.1（+）表达载体上，使用 TAKARA 公司的 HindIII及 xhoI 快切酶对该质粒进行酶切鉴定，结果显示正确（图 4.3B）。酶切鉴定后，将正确的质粒送生工测序公司测序 TP53 的正向测序结果显示基因序列发现第 6 个碱基 G 突变成 A, 即谷氨酸 GAG 突变成 GAA，视为氨基酸发生同义突变（图 4.3C）。因突变并不会影响氨基酸的特性，则将继续使用该基因进行特性及功能探讨。
图 4.3 构建 pcDNA3.1-TP53 质粒。（A）PCR 扩增 TP53 基因，在 1200 bp 左右出现 TP5基因的条带；1 和 2，两个生物学重复。(B) 酶切鉴定 pcDNA3.1-TP53 质粒，在 2000 b附近出现 PTEN-L-P53 条带；1，pcDNA3.1（+）空载体；2，3，4 和 5，pcDNA3.1-TP5质粒，四个生物学重复。（C）正向测序结果显示 TP53 序列中第 2 个密码子发生了同义突变，谷氨酸 GAG 突变成了 GAA。4.4 PTEN-L-p53 在 HEK293T 细胞中过表达PTEN-L leader 也许能够作为一个安全有效的载体将 p53 直接传送至靶细胞从而发挥 p53 的生物学功能。我们将 PTEN-L leader 与野生型 TP53 基因通过 PCR 技术进行融合，形成融合基因 PTEN-L-p53。PTEN-L-p53 基因连接到 pSecTag2 A 载体上，该载体上含有翻译起始密码子 ATG，因此，我们在设计引物时并没有修改 PTEN-Lleader 的起始密码子 CTG。除此以外，pSecTag2 A 载体中包含一个鼠源的 Ig 信号肽 (ISP)，连入PTEN-L-p53 后，加在融合基因的 N 端，能够促进该融合蛋白的分泌。pSecTag2A 中还
【参考文献】：
期刊论文
[1]A PTEN translational isoform has PTEN-like activity[J]. Xie Zhang,Bowei Yin,Fangfang Zhu,Guochang Huang,Hong Li. Chinese Journal of Cancer Research. 2015(05)
本文编号：3088746
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