自噬调控肺腺癌A549/DDP细胞顺铂耐药的机制研究
发布时间：2021-03-23 08:11
目的探讨自噬在A549/DDP细胞顺铂耐药中的作用及机制。方法采用MTS法检测A549/DDP细胞及其亲本A549细胞对DDP耐药性,计算A549/DDP细胞顺铂耐药指数。通过Western blot、激光共聚焦和透射电子显微镜等方法检测A549/DDP细胞及其亲本A549细胞的自噬活性。使用DDP处理A549/DDP细胞,Western blot和RT-qPCR检测DDP对自噬相关蛋白和基因表达的影响,初步探讨其潜在的机制。构建自噬关键基因敲低的A549/DDP细胞模型,采用MTS法验证自噬对DDP耐药性的影响。结果A549/DDP细胞对A549细胞顺铂耐药指数为6.22,为中等耐药细胞株。A549/DDP细胞中LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬关键蛋白表达水平明显高于A549细胞。使用DDP处理A549/DDP细胞后,LC3B、ATG5、Beclin1和ATG7等自噬关键蛋白表达水平下降,ATG5、Beclin1和ATG7的m RNA表达水平也显著下降（p<0.05）,且呈现出时间依赖性和剂量依赖性。DDP可通过下调AMPKα和MiTF表达水平（p<0....
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1DDP对A549细胞和A549/DDP细胞增殖的影响
重庆医科大学硕士研究生学位论文182.1.2A549/DDP细胞自噬活性表达高于其亲本A549细胞我们通过多种方法检测A549细胞与A549/DDP细胞自噬活性。Westernblot结果显示，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有较高的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值（自噬活性标记），而p62/SQSTM1的表达则较低（自噬基质），表明A549/DDP具有更高的自噬活性，并且自噬通量很流畅（图2.1B）。免疫荧光分析显示，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有更高的LC3B表达量（图2.1C），同时透射电子显微镜（TEM）的结果也表明，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有更多的自噬泡（图2.1D）。最后，我们检测了几种关键的自噬相关蛋白的表达水平。Westernblot结果显示，A549/DDP细胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表达水平高于A549细胞。通过上述数据可以表明A549/DDP细胞的自噬活性高于其亲本A549细胞。图2.1.2Westernblot检测自噬关键蛋白在A549和A549/DDP细胞中的表达B.Westernblot测定A549和A549/DDP细胞中LC3B和p62的表达水平；C.A549和A549/DDP细胞中LC3B斑点（红色信号）的免疫荧光分析，DAPI（蓝色信号）用于染核,比例尺，20μm；D.TEM用于观察A549和A549/DDP细胞中的自噬泡,下图是放大图像。红色箭头表示自噬泡。比例尺（上图）为2μm，比例尺（下图）为1μm；E.Westernblot测定A549和A549/DDP细胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表达水平。GAPDH用作上样对照并
活性的潜在基因，我们使用RT-qPCR法检测了主要自噬基因的mRNA表达，包括ULK1，ATG3，ATG4B，ATG4D，ATG5，BECN1，ATG7，ATG10，ATG12，ATG13，ATG14和ATG16L1。同样采用不同时间点和药物剂量来处理A549/DDP细胞。我们的结果表明，30μMDDP处理A549/DDP细胞后，在时间点组ATG5、BECN1、ATG7和ATG10的mRNA表达水平以时间依赖性方式显著降低（图2.3A）；同时，在药物剂量组ATG5，BECN1，ATG7和ATG10的mRNA表达水平以剂量依赖性显著降低（图2.3B）。这些结果表明DDP处理可通过抑制几个关键自噬基因的mRNA表达来抑制自噬活性。图2.3DDP处理降低A549/DDP细胞关键自噬基因的表达A.QPCR检测30μMDDP处理A549/DDP细胞0h，6h，12h后，自噬关键基因的表达。（p<0.05）；
【参考文献】：
期刊论文
[1]2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J]. 郑荣寿,孙可欣,张思维,曾红梅,邹小农,陈茹,顾秀瑛,魏文强,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2019 (01)
[2]Autophagy and multidrug resistance in cancer[J]. Ying-Jie Li,Yu-He Lei,Nan Yao,Chen-Ran Wang,Nan Hu,Wen-Cai Ye,Dong-Mei Zhang,Zhe-Sheng Chen. Chinese Journal of Cancer. 2017(08)
本文编号：3095475
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1DDP对A549细胞和A549/DDP细胞增殖的影响
重庆医科大学硕士研究生学位论文182.1.2A549/DDP细胞自噬活性表达高于其亲本A549细胞我们通过多种方法检测A549细胞与A549/DDP细胞自噬活性。Westernblot结果显示，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有较高的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值（自噬活性标记），而p62/SQSTM1的表达则较低（自噬基质），表明A549/DDP具有更高的自噬活性，并且自噬通量很流畅（图2.1B）。免疫荧光分析显示，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有更高的LC3B表达量（图2.1C），同时透射电子显微镜（TEM）的结果也表明，与A549细胞相比，A549/DDP细胞具有更多的自噬泡（图2.1D）。最后，我们检测了几种关键的自噬相关蛋白的表达水平。Westernblot结果显示，A549/DDP细胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表达水平高于A549细胞。通过上述数据可以表明A549/DDP细胞的自噬活性高于其亲本A549细胞。图2.1.2Westernblot检测自噬关键蛋白在A549和A549/DDP细胞中的表达B.Westernblot测定A549和A549/DDP细胞中LC3B和p62的表达水平；C.A549和A549/DDP细胞中LC3B斑点（红色信号）的免疫荧光分析，DAPI（蓝色信号）用于染核,比例尺，20μm；D.TEM用于观察A549和A549/DDP细胞中的自噬泡,下图是放大图像。红色箭头表示自噬泡。比例尺（上图）为2μm，比例尺（下图）为1μm；E.Westernblot测定A549和A549/DDP细胞中Beclin-1，ATG5和ATG7的表达水平。GAPDH用作上样对照并
活性的潜在基因，我们使用RT-qPCR法检测了主要自噬基因的mRNA表达，包括ULK1，ATG3，ATG4B，ATG4D，ATG5，BECN1，ATG7，ATG10，ATG12，ATG13，ATG14和ATG16L1。同样采用不同时间点和药物剂量来处理A549/DDP细胞。我们的结果表明，30μMDDP处理A549/DDP细胞后，在时间点组ATG5、BECN1、ATG7和ATG10的mRNA表达水平以时间依赖性方式显著降低（图2.3A）；同时，在药物剂量组ATG5，BECN1，ATG7和ATG10的mRNA表达水平以剂量依赖性显著降低（图2.3B）。这些结果表明DDP处理可通过抑制几个关键自噬基因的mRNA表达来抑制自噬活性。图2.3DDP处理降低A549/DDP细胞关键自噬基因的表达A.QPCR检测30μMDDP处理A549/DDP细胞0h，6h，12h后，自噬关键基因的表达。（p<0.05）；
【参考文献】：
期刊论文
[1]2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J]. 郑荣寿,孙可欣,张思维,曾红梅,邹小农,陈茹,顾秀瑛,魏文强,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2019 (01)
[2]Autophagy and multidrug resistance in cancer[J]. Ying-Jie Li,Yu-He Lei,Nan Yao,Chen-Ran Wang,Nan Hu,Wen-Cai Ye,Dong-Mei Zhang,Zhe-Sheng Chen. Chinese Journal of Cancer. 2017(08)
本文编号：3095475
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