细胞穿膜肽耦合突变型核转录因子κB抑制剂（NFKBIA）在结直肠癌中的抗肿瘤作用
发布时间：2021-03-25 14:57
目的:结直肠恶性肿瘤是临床诊疗中最常见的消化系统恶性肿瘤之一,近年来在全世界范围内的发病率和死亡率均有明显上升趋势,虽然现代诊疗技术发展迅猛,但总体疗效依然有限。现已证明RAS信号通路激活与恶性肿瘤的发病、进展和恶性程度密切相关,K-Ras突变型结直肠癌患者的后续治疗效果及预后明显差于K-Ras野生型患者。有研究证明IκBα（即NFKBIA）异常积聚细胞核内对K-Ras突变型肿瘤细胞有抑制作用。本课题利用基因拼接、DNA重组技术及重组蛋白表达技术,重头设计序列、构建转染质粒、生产纯化重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS,并研究目的重组蛋白在结直肠癌细胞株中的转入情况及其对抗肿瘤作用如对细胞增殖能力、迁移能力、凋亡情况等的影响。方法:1、通过相关网站查询目的基因序列情况及相关资料,设计并优化重组蛋白CPP2-DN-NFKBIA-NLS基因序列,基因合成后通过载体pET28b（+）质粒分别转染到大肠杆菌BL21（DE3）及大肠杆菌C41感受态细菌中并通过抗生素筛选获得阳性目标大表达菌株。培养阳性菌株后利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导阳性菌株表达并分泌重组蛋白CPP2...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１相关氨基酸序列及重组蛋白简图??－
?第二章重组蛋白的制备???Ｆｉｇｕｒｅ２－２?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ．?ＭＷ：?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ??ｍａｒｋｅｒ．?０：?Ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ）．?Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．ｌ：?ＢＬ２１（ＤＥ３）．??Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．３：?Ｃ４１．??
?硕士学位论文???ＭＷ?２ｕｇ??１３８??６０??４５??３５??２５?－ｗ＃??２０??１５??１０??ＣＰＰ２－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ??图２－４重组蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ最终样品检测??Ｆｉｇｕｒｅ２－４?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｆｉｎａｌ?ｓａｍｐｌｅ?ＱＣ??２．３．２重组质粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ转化及蛋白表达情况??将重组□的质粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ｒＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ分别转化至两种大肠杆菌培??养体系屮：大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＦ３）感受态细胞及大肠杆菌Ｃ４１感受态细胞后，按??操作分别扩大培养后进行抗性筛选可见平板ｈ均长出多个卩丨丨性克降菌落，提示??目的重组质粒己成功转化至目标大肠杆菌培养体系中并通过抗性筛选形成单克??隆菌落，获得了包含目的基因的阳性克隆表达菌株，随后可以进一步分析表达??产物进行阳性克隆菌株的验证。挑选阳性克隆菌株按照上述操作培养后提取??ＮＰＣ和ＤＰＥ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达情况如下图２－５所示：大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）??感受态细胞及大肠杆菌Ｃ’４ｌ感受态细胞中．克降菌株均能成功衣达出口的蚩白，??并且目的重组蛋白在上清与蛋白沉淀屮均冇表达。??２．３．３重组目的蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的纯化流程与产物鉴定??将收集到的包含ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的细胞裂解液通过Ｎｉ－柱纯化，反复??洗脱、浓缩后贮存，纯化过程情况见图２－３。为确定ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ在??大肠杆菌内是否正确表达，本实验进？步用特异性６
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification and characterization of a novel bipartite nuclear localization signal in the hepatitis B virus polymerase[J]. Joachim Lupberger,Stephanie Schaedler,Alexander Peiran,Eberhard Hildt. World Journal of Gastroenterology. 2013(44)
本文编号：3099870
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１相关氨基酸序列及重组蛋白简图??－
?第二章重组蛋白的制备???Ｆｉｇｕｒｅ２－２?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ．?ＭＷ：?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ??ｍａｒｋｅｒ．?０：?Ｎｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ）．?Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．ｌ：?ＢＬ２１（ＤＥ３）．??Ｓｔｒａｉｎ?Ｎｏ．３：?Ｃ４１．??
?硕士学位论文???ＭＷ?２ｕｇ??１３８??６０??４５??３５??２５?－ｗ＃??２０??１５??１０??ＣＰＰ２－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ??图２－４重组蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ最终样品检测??Ｆｉｇｕｒｅ２－４?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ?ｆｉｎａｌ?ｓａｍｐｌｅ?ＱＣ??２．３．２重组质粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ转化及蛋白表达情况??将重组□的质粒ｐＥＴ２８Ａ（＋）－ｒＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ分别转化至两种大肠杆菌培??养体系屮：大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＦ３）感受态细胞及大肠杆菌Ｃ４１感受态细胞后，按??操作分别扩大培养后进行抗性筛选可见平板ｈ均长出多个卩丨丨性克降菌落，提示??目的重组质粒己成功转化至目标大肠杆菌培养体系中并通过抗性筛选形成单克??隆菌落，获得了包含目的基因的阳性克隆表达菌株，随后可以进一步分析表达??产物进行阳性克隆菌株的验证。挑选阳性克隆菌株按照上述操作培养后提取??ＮＰＣ和ＤＰＥ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达情况如下图２－５所示：大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）??感受态细胞及大肠杆菌Ｃ’４ｌ感受态细胞中．克降菌株均能成功衣达出口的蚩白，??并且目的重组蛋白在上清与蛋白沉淀屮均冇表达。??２．３．３重组目的蛋白ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的纯化流程与产物鉴定??将收集到的包含ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ的细胞裂解液通过Ｎｉ－柱纯化，反复??洗脱、浓缩后贮存，纯化过程情况见图２－３。为确定ＣＰＰ２－ＤＮ－ＮＦＫＢＩＡ－ＮＬＳ在??大肠杆菌内是否正确表达，本实验进？步用特异性６
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification and characterization of a novel bipartite nuclear localization signal in the hepatitis B virus polymerase[J]. Joachim Lupberger,Stephanie Schaedler,Alexander Peiran,Eberhard Hildt. World Journal of Gastroenterology. 2013(44)
本文编号：3099870
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3099870.html
