敲除小鼠乳腺癌细胞整合素基因抑制其侵袭转移能力的作用研究

发布时间：2021-04-07 05:54

　　1.目的利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的整合素αavβ3基因,构建稳定敲除整合素cxvβ3基因的4T1细胞株;分析阻断骨唾液酸蛋白（BSP）与整合素的结合后乳腺癌细胞增殖、迁移和粘附能力的变化,检测细胞内PI3K、AKT、ERK、NF-κB p65和IκBa表达水平和其磷酸化水平的变化,进而探讨阻断整合素表达抑制乳腺癌骨转移的作用。2.方法（1）根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,分别在整合素αv和β3亚基基因的外显子区域设计2条sgRNA,构建lentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态Stbl3,筛选出重组质粒进测序验证后转染至HEK293Ft细胞包装成慢病毒。（2）慢病毒感染4T1细胞后用嘌呤霉素加压筛选稳定转染细胞,用有限稀释法分离培养单克隆细胞。（3）提取单克隆细胞基因组DNA后对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序,用qRT-PCR检测稳定敲除细胞株整合素αv和β3亚基mRNA的表达,Western blot检测细胞株整合素αvβ3蛋白质的表达。（4）用CCK-8检测小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活性,用划痕实验和transwell检测... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１?ｌｅｎｔｉＣＲ丨ＳＰＲｖ２质粒结构??

Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４确定嘌呤霉素筛选细胞的浓度??不同浓度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１细胞后各时间点细胞的状态如图１－５所??示，从图中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞基本没有杀伤作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞有一定的杀伤作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞的杀??伤作用明显，作用４８ｈ后镜下只见少数的细胞存活，７２ｈ则在镜下只见极少数几??个细胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后镜下只见极少数儿个存活细胞，而??１９??

??３．３细胞转染包装慢病毒结果??质粒转染２９３Ｆｔ细胞后的效果情况如图丨－４所示，从图１￣４阳性对照质粒??ｐＥＧＦＰ转染２９３Ｆｔ细胞后产生绿色荧光的情况可知此次转染包装慢病毒效果可??行，提示包装出的慢病毒可用于感染目的细胞。??ｗｍｍ?ｍ??■ｈ?ｍ??１２ｈ?２４ｈ??图１￣４阳性对照质粒ｐＥＧＦＰ转染２９３Ｆｔ细胞后效果情况（ｌＯＯｘ）??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４确定嘌呤霉素筛选细胞的浓度??不同浓度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１细胞后各时间点细胞的状态如图１－５所??示，从图中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞基本没有杀伤作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞有一定的杀伤作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素对４Ｔ１细胞的杀??伤作用明显，作用４８ｈ后镜下只见少数的细胞存活，７２ｈ则在镜下只见极少数几??个细胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后镜下只见极少数儿个存活细胞，而??１９??


本文编号：3122934