ID1参与急性髓系白血病地西他滨耐药的研究
发布时间：2021-04-20 19:16
目的:近年来地西他滨（decitabine,DAC）在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）的治疗中取得了较大进展,但部分患者在应用DAC治疗过程中由于原发耐药或者继发耐药而导致治疗失败和疾病进展。我们的前期研究发现DNA结合抑制因子1（inhibitor of DNA binding 1,ID1）可能参与DAC耐药,本研究拟采用过表达和沉默ID1表达的方法,分析ID1对白血病细胞生物学功能的影响,探讨其在DAC耐药中的作用机制。方法:（1）采用基因过表达技术将ID1通过慢病毒转染白血病细胞株K562和HL60,获得稳定过表达ID1的K562和HL60细胞（ID1-K562、ID1-HL60）及其对照组细胞（NCK562、NC-HL60）;采用基因沉默技术将shID1基因通过慢病毒转染DAC耐药K562细胞株（K562/DAC）,经筛选获得ID1沉默的K562/DAC细胞（shID1-K562/DAC）及其对照组细胞（shNC-K562/DAC）;采用实时荧光定量PCR法（real-time quantitative PCR,RQPCR）和蛋白免疫印迹法...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 急性髓系白血病
1.2 地西他滨在AML治疗中的应用及其耐药情况
1.3 DNA结合抑制因子1
1.4 miR-29b-ID1 异常可能参与DAC耐药
第二章 研究的目的、方法与技术、方案设计及意义
2.1 研究目的
2.2 研究的方法与技术
2.2.1 实时荧光定量PCR（RQ-PCR）
2.2.2 慢病毒转染技术
2.2.3 细胞培养技术
2.2.4细胞功能学实验
2.2.5 裸鼠皮下移植瘤建立
2.2.6 蛋白免疫印迹技术（Western blot）
2.3 研究方案设计
2.3.1 ID1 过表达对白血病细胞生物学功能的影响
2.3.2 沉默ID1对DAC耐药白血病细胞生物学功能影响
2.3.3 miR-29b-ID1 信号对K562/DAC的生物学功能影响
2.4 研究意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞
3.1.2 Balb/c裸鼠
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要仪器
3.1.5 引物
3.2 实验方法
3.2.1 骨髓有核细胞的分离
3.2.2 总RNA提取
3.2.3 RNA逆转录
3.2.4 RQ-PCR检测ID1和miR-29b基因的表达
3.2.5 亚硫酸氢盐测序法（BSP）
3.2.6 PCR产物的纯化与回收
3.2.7 构建重组载体
3.2.8 重组质粒提取、鉴定及测序
3.2.9 细胞培养
3.2.10 慢病毒转染
3.2.11 台盼蓝拒染法
3.2.12 细胞计数法检测细胞生长
3.2.13 半抑制浓度（IC50）检测（计数法）
3.2.14 Annexin V-PE/7-AAD方法检测细胞凋亡
3.2.15 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测蛋白表达水平
3.2.16 裸鼠皮下移植瘤模型建立
3.2.17 统计学分析
第四章 实验结果
4.1 ID1 过表达对白血病细胞生物学功能的影响
4.1.1 构建ID1 过表达的K562和HL60 细胞株
4.1.2 RQ-PCR和 Western blot法鉴定ID1 在转染细胞中的表达水平
4.1.3 ID1 过表达对K562和HL60 细胞生长的影响
4.1.4 ID1对K562和HL60 细胞凋亡的影响
4.1.5 ID1 过表达对K562和HL60 细胞DAC耐药性的影响
4.1.6 ID1 过表达在小鼠体内促进肿瘤生长,增加白血病细胞对DAC的耐药性
4.2 沉默ID1对DAC耐药白血病细胞的生物学影响
4.2.1 RQ-PCR检测DAC耐药白血病细胞株中ID1 表达水平
4.2.2 沉默ID1在K652/DAC细胞株中的表达
4.2.3 沉默ID1对K562/DAC生长的影响
4.2.4 沉默ID1对K562/DAC耐药性的影响
4.3 miR-29b-ID1 信号对K562/DAC生物学功能的影响
4.3.1 ID1在K562和K562/DAC细胞株中的表达和甲基化水平
4.3.2 构建miR-29b过表达的DAC耐药K562 细胞株
4.3.3 miR-29b过表达对K562/DAC细胞生长的影响
4.3.4 miR-29b可通过降低ID1 的表达增加K562/DAC细胞对DAC敏感性
第五章 讨论
参考文献
第六章 结论及展望
主要结论
展望
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]地西他滨治疗血液系统疾病的研究进展[J]. 彭岚,邵宗鸿. 国际输血及血液学杂志. 2019 (01)
博士论文
[1]去甲基化药物治疗较高危骨髓增生异常综合征的疗效预测及耐药相关机制的研究[D]. 吴萍.南方医科大学 2016
硕士论文
[1]地西他滨对K562细胞、K562/ADR细胞及原发耐药的AML原代细胞中多药耐药基因MDR1和P170耐药蛋白的影响[D]. 魏阳璇.河北医科大学 2018
[2]MiR-29b/c在AML中的表达及参与地西他滨耐药研究[D]. 杨东琴.江苏大学 2017
本文编号：3150248
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 急性髓系白血病
1.2 地西他滨在AML治疗中的应用及其耐药情况
1.3 DNA结合抑制因子1
1.4 miR-29b-ID1 异常可能参与DAC耐药
第二章 研究的目的、方法与技术、方案设计及意义
2.1 研究目的
2.2 研究的方法与技术
2.2.1 实时荧光定量PCR（RQ-PCR）
2.2.2 慢病毒转染技术
2.2.3 细胞培养技术
2.2.4细胞功能学实验
2.2.5 裸鼠皮下移植瘤建立
2.2.6 蛋白免疫印迹技术（Western blot）
2.3 研究方案设计
2.3.1 ID1 过表达对白血病细胞生物学功能的影响
2.3.2 沉默ID1对DAC耐药白血病细胞生物学功能影响
2.3.3 miR-29b-ID1 信号对K562/DAC的生物学功能影响
2.4 研究意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 细胞
3.1.2 Balb/c裸鼠
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要仪器
3.1.5 引物
3.2 实验方法
3.2.1 骨髓有核细胞的分离
3.2.2 总RNA提取
3.2.3 RNA逆转录
3.2.4 RQ-PCR检测ID1和miR-29b基因的表达
3.2.5 亚硫酸氢盐测序法（BSP）
3.2.6 PCR产物的纯化与回收
3.2.7 构建重组载体
3.2.8 重组质粒提取、鉴定及测序
3.2.9 细胞培养
3.2.10 慢病毒转染
3.2.11 台盼蓝拒染法
3.2.12 细胞计数法检测细胞生长
3.2.13 半抑制浓度（IC50）检测（计数法）
3.2.14 Annexin V-PE/7-AAD方法检测细胞凋亡
3.2.15 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测蛋白表达水平
3.2.16 裸鼠皮下移植瘤模型建立
3.2.17 统计学分析
第四章 实验结果
4.1 ID1 过表达对白血病细胞生物学功能的影响
4.1.1 构建ID1 过表达的K562和HL60 细胞株
4.1.2 RQ-PCR和 Western blot法鉴定ID1 在转染细胞中的表达水平
4.1.3 ID1 过表达对K562和HL60 细胞生长的影响
4.1.4 ID1对K562和HL60 细胞凋亡的影响
4.1.5 ID1 过表达对K562和HL60 细胞DAC耐药性的影响
4.1.6 ID1 过表达在小鼠体内促进肿瘤生长,增加白血病细胞对DAC的耐药性
4.2 沉默ID1对DAC耐药白血病细胞的生物学影响
4.2.1 RQ-PCR检测DAC耐药白血病细胞株中ID1 表达水平
4.2.2 沉默ID1在K652/DAC细胞株中的表达
4.2.3 沉默ID1对K562/DAC生长的影响
4.2.4 沉默ID1对K562/DAC耐药性的影响
4.3 miR-29b-ID1 信号对K562/DAC生物学功能的影响
4.3.1 ID1在K562和K562/DAC细胞株中的表达和甲基化水平
4.3.2 构建miR-29b过表达的DAC耐药K562 细胞株
4.3.3 miR-29b过表达对K562/DAC细胞生长的影响
4.3.4 miR-29b可通过降低ID1 的表达增加K562/DAC细胞对DAC敏感性
第五章 讨论
参考文献
第六章 结论及展望
主要结论
展望
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]地西他滨治疗血液系统疾病的研究进展[J]. 彭岚,邵宗鸿. 国际输血及血液学杂志. 2019 (01)
博士论文
[1]去甲基化药物治疗较高危骨髓增生异常综合征的疗效预测及耐药相关机制的研究[D]. 吴萍.南方医科大学 2016
硕士论文
[1]地西他滨对K562细胞、K562/ADR细胞及原发耐药的AML原代细胞中多药耐药基因MDR1和P170耐药蛋白的影响[D]. 魏阳璇.河北医科大学 2018
[2]MiR-29b/c在AML中的表达及参与地西他滨耐药研究[D]. 杨东琴.江苏大学 2017
本文编号：3150248
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3150248.html
