miR-146b靶向Rac1调控卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究
发布时间：2021-06-16 21:56
目的本实验室前期研究发现miR-146b能引起卵巢癌细胞骨架排列紊乱,抑制卵巢癌侵袭转移。在此基础上,本课题以miR-146b的靶基因为切入点,从肌动蛋白骨架和细胞间连接角度解析miR-146b引起卵巢上皮细胞癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞形态改变,进而抑制细胞迁移和侵袭的机制。方法1.利用生物信息学方法预测miR-146b的靶基因,将其中评分较高且与维持细胞形态密切相关的Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）作为候选靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证其与miR-146b的靶向关系。2.免疫印迹检测瞬时或稳定过表达miR-146b对Rac1蛋白表达水平的影响。3.构建两个pLKO.1-puro Rac1 shRNA慢病毒载体,分别包装后感染卵巢癌细胞,免疫印迹验证Rac1敲减水平。4.倒置显微镜观察稳定敲减Rac1的卵巢癌细胞形态,免疫印迹检测细胞肌动蛋白和紧密连接蛋白1（zonula occludens-1,ZO-1）的表达水平,免疫荧光染色后采用共聚焦荧...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miRNA的生物合成和效应途径[28]
miR-146b作用于Rac1调控人卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究16（14）15%分离胶：ddH2O500μL，30%丙烯酰胺2.5mL，1.5MTris-HCl（pH=8.8）1.9mL，10%SDS50μL，10%APS50μL，最后加TEMED2μL。（15）浓缩胶×2：ddH2O2.1mL、30%丙烯酰胺500μL、1.5MTris-HCl（pH=6.8）380μL、10%SDS30μL、10%APS30μL、最后加TEMED3μL，3.1.5质粒图谱图3.1psiCHECKTM-2质粒图谱[76]Figure3.1PlasmidmapofpsiCHECKTM-2[76]3.2实验方法3.2.1细胞培养HEK-293T、SKOV3和HO8910均采用含10%FBS和100U/ml青链霉素的高糖DMEM培养基，置5%CO2、37℃恒温培养箱培养、传代。3.2.1.1细胞传代取出生长状态良好的细胞，移液枪贴壁弃去废旧的培养基，用37℃PBS洗涤细胞两次。均匀滴加刚好能铺满培养皿底部的胰酶，显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆时立刻加入等体积的培养基终止消化。用移液枪将贴壁的细胞吹打并转移至15mL离心管中，800rpm离心5min。弃去上清，用1mL培养基重悬，在培养皿中加入3-4mL培养基，按实验需求吸取合适的细胞悬液传代。3.2.1.2细胞冻存将细胞汇合度约90%的细胞同3.2.1.1操作得细胞沉淀，用500μL培养基重悬。按照DMEM:FBS:DMSO=8:9:3的比例制备冻存液，和细胞悬液等比例混合后转移至冻存管，梯度冻存4℃30min、-20℃120min，最后于-80℃短期保存或液氮长期保存。3.2.2Rac13’UTR荧光报告基因载体的构建
江苏大学硕士学位论文253.3.1生物信息学预测miR-146b的靶基因用三种生物信息学软件miRanda、miRDB、miRWalk综合预测出miR-146b可能的靶基因，从中挑选出与细胞骨架、肿瘤转移等生物学行为高度相关的基因Rac1，针对其种子序列设计突变序列，见图3.2。图3.2miR-146b与Rac1的结合分析及针对种子序列（下划线）设计的突变序列Figure3.2BioinformaticpredictionofRac1astargetofmiR-146bandputativeseed-pairregionwasinred3.3.2双荧光素酶报告基因实验验证miR-146b靶向Rac1双荧光素酶报告基因实验是确定miRNA靶基因的金标准[77]，为了验证Rac1是miR-146b的靶基因，我们将进行双荧光素酶报告基因实验，并采用已报道的miR-146b的靶基因Fbxl10作为阳性参照。3.3.2.1Rac13’UTR荧光报告基因载体及其突变体的鉴定为了满足双荧光素酶报告基因的实验需求，本研究构建了两个报告基因质粒，一个是在psiCHECKTM-2载体中插入Rac13’-UTR全长序列（1521bp），命名为psiCHECK2-Rac1-3’UTR，另一个是采用重叠PCR法将Rac13’-UTR中与miR-146b结合的种子序列突变后插入psiCHECK2载体中得到的psiCHECK2-Rac1-3’mut载体。琼脂糖凝胶电泳结果显示，五个psiCHECK2-Rac1-3’UTR载体的样本经PCR扩增后可于1521bp处发现条带，psiCHECK2-Rac1-3’mut载体经PCR扩增后仅样本7、9、11于1521bp处可见条带，见图3.3。选取PCR鉴定成功的样本1和7送至公司测序，测序结果证实插入psiCHECKTM-2载体的序列与Rac1-3’UTR或Rac1-3’mut片段一致，说明两个载体psiCHECK2-Rac1-3’UTR和psiCHECK2-Rac1-3’mut均构建成功。
【参考文献】：
博士论文
[1]miR-146b在卵巢上皮细胞癌中的作用及机制研究[D]. 闫美娜.江苏大学 2018
本文编号：3233861
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miRNA的生物合成和效应途径[28]
miR-146b作用于Rac1调控人卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究16（14）15%分离胶：ddH2O500μL，30%丙烯酰胺2.5mL，1.5MTris-HCl（pH=8.8）1.9mL，10%SDS50μL，10%APS50μL，最后加TEMED2μL。（15）浓缩胶×2：ddH2O2.1mL、30%丙烯酰胺500μL、1.5MTris-HCl（pH=6.8）380μL、10%SDS30μL、10%APS30μL、最后加TEMED3μL，3.1.5质粒图谱图3.1psiCHECKTM-2质粒图谱[76]Figure3.1PlasmidmapofpsiCHECKTM-2[76]3.2实验方法3.2.1细胞培养HEK-293T、SKOV3和HO8910均采用含10%FBS和100U/ml青链霉素的高糖DMEM培养基，置5%CO2、37℃恒温培养箱培养、传代。3.2.1.1细胞传代取出生长状态良好的细胞，移液枪贴壁弃去废旧的培养基，用37℃PBS洗涤细胞两次。均匀滴加刚好能铺满培养皿底部的胰酶，显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆时立刻加入等体积的培养基终止消化。用移液枪将贴壁的细胞吹打并转移至15mL离心管中，800rpm离心5min。弃去上清，用1mL培养基重悬，在培养皿中加入3-4mL培养基，按实验需求吸取合适的细胞悬液传代。3.2.1.2细胞冻存将细胞汇合度约90%的细胞同3.2.1.1操作得细胞沉淀，用500μL培养基重悬。按照DMEM:FBS:DMSO=8:9:3的比例制备冻存液，和细胞悬液等比例混合后转移至冻存管，梯度冻存4℃30min、-20℃120min，最后于-80℃短期保存或液氮长期保存。3.2.2Rac13’UTR荧光报告基因载体的构建
江苏大学硕士学位论文253.3.1生物信息学预测miR-146b的靶基因用三种生物信息学软件miRanda、miRDB、miRWalk综合预测出miR-146b可能的靶基因，从中挑选出与细胞骨架、肿瘤转移等生物学行为高度相关的基因Rac1，针对其种子序列设计突变序列，见图3.2。图3.2miR-146b与Rac1的结合分析及针对种子序列（下划线）设计的突变序列Figure3.2BioinformaticpredictionofRac1astargetofmiR-146bandputativeseed-pairregionwasinred3.3.2双荧光素酶报告基因实验验证miR-146b靶向Rac1双荧光素酶报告基因实验是确定miRNA靶基因的金标准[77]，为了验证Rac1是miR-146b的靶基因，我们将进行双荧光素酶报告基因实验，并采用已报道的miR-146b的靶基因Fbxl10作为阳性参照。3.3.2.1Rac13’UTR荧光报告基因载体及其突变体的鉴定为了满足双荧光素酶报告基因的实验需求，本研究构建了两个报告基因质粒，一个是在psiCHECKTM-2载体中插入Rac13’-UTR全长序列（1521bp），命名为psiCHECK2-Rac1-3’UTR，另一个是采用重叠PCR法将Rac13’-UTR中与miR-146b结合的种子序列突变后插入psiCHECK2载体中得到的psiCHECK2-Rac1-3’mut载体。琼脂糖凝胶电泳结果显示，五个psiCHECK2-Rac1-3’UTR载体的样本经PCR扩增后可于1521bp处发现条带，psiCHECK2-Rac1-3’mut载体经PCR扩增后仅样本7、9、11于1521bp处可见条带，见图3.3。选取PCR鉴定成功的样本1和7送至公司测序，测序结果证实插入psiCHECKTM-2载体的序列与Rac1-3’UTR或Rac1-3’mut片段一致，说明两个载体psiCHECK2-Rac1-3’UTR和psiCHECK2-Rac1-3’mut均构建成功。
【参考文献】：
博士论文
[1]miR-146b在卵巢上皮细胞癌中的作用及机制研究[D]. 闫美娜.江苏大学 2018
本文编号：3233861
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