基于滚环扩增合成的多价适配体快速检测浆膜腔积液中肿瘤细胞的实验研究

发布时间：2021-06-27 12:02

　　目的基于多价适配体构建一种简单快速的肿瘤细胞的检测方法。方法通过滚环扩增反应形成多价适配体的长链支架（含重复的Poly T）,与靶向核仁素的AS1411适配体荧光信号链（带有Ploy A）杂交后,构建多价适配体识别探针Multi-AS1411-LS,并对其进行表征。用流式细胞和共聚焦显微镜分析Multi-AS1411-LS探针对肿瘤细胞识别的可行性,并进一步对识别条件进行了优化,最后对临床浆膜腔积液标本中的肿瘤细胞进行检测,评价其特异性和敏感性。结果构建的多价适配体识别探针在室温下5 min即可识别肿瘤细胞,比单价的AS1411适配体识别肿瘤细胞的荧光强度高100倍左右,且最低检测限为3个细胞。该多价适配体识别探针在临床标本肿瘤细胞检测中,能很好地区分良恶性细胞,敏感度为87.80%,特异性为93.10%。结论基于滚环扩增合成的多价适配体能快速检测浆膜腔积液中肿瘤细胞,操作方法简单,有较好的特异性和敏感度。 

【文章来源】：第三军医大学学报. 2020,42(23)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

基于滚环合成的多价适配体对肿瘤细胞快速 诊断的原理示意图

为了证实环状模板的成功制备以及滚环扩增的DNA长链的合成,使用凝胶电泳对不同的反应产物进行分析。成环后的模板明显要比预成环的单链迁移得慢且亮度更高,滚环产物滞留在加样孔内,反应时间为15 min后的产物条带中不见多余的成环产物(图2)。说明短时间内即可获得较大分子量的滚环产物。由于AS1411是富G序列,可形成G-四链体,硫黄素T(thioflavin T,ThT)是一种水溶性荧光染料,与G-四链体的结合会导致可见光区的发射增强,形成特征性的荧光光谱(图3A)。在最大发射波长485 nm处,与ThT结合后,Multi-AS1411-LS探针较单价AS1411的荧光强度明显升高(P<0.01,图3B)。滚环产物经过热激活后荧光很弱(图3C),表明滚环产物经热激活后没有聚集现象的发生,而Multi-AS1411-LS与Evagreen结合后荧光强度很高,证实了其杂交的成功。Zeta电位检测结果显示,与单价Zeta电位相比,Multi-AS1411-LS的电荷明显增多(P<0.01,图3D)。这也可证实Multi-AS1411-LS的成功制备。

特异性检测结果显示,A549(人非小细胞肺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)这3种肿瘤细胞株的荧光信号均大幅增强,而BE-AS-2B(人正常肺支气管上皮细胞)细胞株未被Multi-AS1411-LS探针识别,未观察到荧光信号,见图6。图4 流式细胞仪分析Multi-AS1411-LS探针与A549细胞结合情况


本文编号：3252810