骨肉瘤中缺氧诱导HIF-1α调控乳酸脱氢酶-A的机制研究

发布时间：2017-04-25 23:00

  本文关键词：骨肉瘤中缺氧诱导HIF-1α调控乳酸脱氢酶-A的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:明确骨肉瘤细胞缺氧条件下HIF-1α调控乳酸脱氢酶-A的分子机制及乳酸脱氢酶-A对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响。方法:1.免疫组化分析18例临床标本,确认乳酸脱氢酶-A在骨肉瘤患者中的表达情况;2.实时荧光定量PCR检测分析骨肉瘤细胞系MG63细胞在常氧条与缺氧条件下乳酸脱氢酶-A的表达情况。蛋白印记法检测骨肉瘤细胞系MG3细胞在常氧条与缺氧条件下乳酸脱氢酶-A及HIF-1蛋白水平的表达情况。3.构建含有乳酸脱氢酶-A启动子区的萤光素酶报告载体,通过免疫荧光素酶活性实验检测MC63细胞缺氧诱导表达的内源性HIF-1是否对乳酸脱氢酶-A具有调控作用,并进一步明确HIF-1对乳酸脱氢酶-A的调控位点;常氧下转染HIF-1过表达质粒,观察外源性HIF-1的表达对乳酸脱氢酶-A的调控作用及位点。4.构建HIF-1敲除质粒并转染MG63细胞,对比常氧条件与缺氧条件下,敲除HIF-1后是否能有效抑制乳酸脱氢酶-A的表达,从而进一步反正HIF-1对乳酸脱氢酶-A的调控。5.构建乳酸脱氢酶-A敲除质粒,缺氧条件下培养MG63细胞,通过细胞划痕实验,观察敲除乳酸脱氢酶-A对MG63细胞的迁移能力的影响。6.通过细胞活性检测实验,检测缺氧条件下敲除乳酸脱氢酶-A后,MG63细胞的细胞活力及增殖情况。结果:1.乳酸脱氢酶-A在大多数骨肉临床样本中高表达,在检测的18例临床样本中,4例弱阳性、8呈阳性、6例呈强阳性,阳性率达80%;2.缺氧条件下,RT-PCR检测MG63细胞中乳酸脱氢酶-A表达明显上调,与常氧条件相比较差异具有统计学意义(p0.05);3.通过荧光素酶报告实验,我们发现缺氧条件下HIF-1可诱导乳酸脱氢酶-A的表达,其调控关系主要通过结合乳酸脱氢酶-A启动子区的缺氧诱导元件-D介导。4.通过RNA干扰技术,缺氧条件下敲除HIF-1α后,明显的抑制了缺氧对乳酸脱氢酶-A表达的诱导;5.通过划痕实验,我们发现缺氧条件下MG63细胞敲除乳酸脱氢酶-A后,能明显抑制其迁移能力;6.通过细胞活性实验检测,缺氧条件下MG63细胞敲除乳酸脱氢酶-A后,其增殖能力受到一定程度的抑制,与未敲除组比较不具统计学意义。结论:本研究发现骨肉瘤组织中,肿瘤内部常处于缺氧状态,缺氧的微环境下HIF-1表达上调,并通过与乳酸脱氢酶A启动子区的缺氧诱导原件-D结合激活其表达。同时,我们还发现乳酸脱氢酶A可以促进骨肉细胞的迁移,但对肉瘤细胞的增殖活性未见明显影响。
【关键词】：缺氧 HIF-1 乳酸脱氢酶-A 骨肉瘤
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 引言9-11
• 1 材料与方法11-32
• 1.1 主要仪器与器材11-14
• 1.2 实验细胞14
• 1.3 实验标本14-15
• 1.4 实验方法15-29
• 1.4.1 实验一15
• 1.4.2 实验二15-17
• 1.4.3 实验三17-19
• 1.4.4 实验四19-23
• 1.4.5 实验五23-26
• 1.4.6 实验六26-28
• 1.4.7 实验七28-29
• 统计学方法29-32
• 2 实验结果32-45
• 2.1 乳酸脱氢酶-A在骨肉临床样本中高表达32-35
• 2.2 缺氧可诱导MG63细胞高表达乳酸脱氢酶-A35-37
• 2.3 HIF-1 通过绑定HER-D调控缺氧诱导乳酸脱氢酶-A的表达37-39
• 2.4 敲除HIF-1Α可消除缺氧对乳酸脱氢酶-A表达的诱导39-41
• 2.5 缺氧条件下，MG63细胞敲除乳酸脱氢酶-A后，，能明显抑制其迁移能力41-42
• 2.6 缺氧条件下，MG63细胞敲除乳酸脱氢酶-A后，其增殖能力受到一定程度的抑制42-45
• 3 讨论45-59
• 3.1 骨肉瘤的流行病学及治疗情况45-47
• 3.2 缺氧对骨肉细胞的恶性生物学行为的影响47-49
• 3.3 HIF-1 与缺氧的关系49-50
• 3.4 HIF与恶性肿瘤的关系50-53
• 3.5 HIF-1 与肿瘤的治疗53-54
• 3.6 乳酸脱氢酶的结构及生物学作用54-56
• 3.7 HIF-1 与乳酸脱氢酶的关系56-57
• 3.8 乳酸脱氢酶A对骨肉瘤恶性生物学行为的影响57-59
• 结论59-60
• 参考文献60-66
• 综述 骨肉瘤治疗研究进展66-71
• 参考文献70-71
• 致谢71-74
• 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果74-75

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