CFTR基因在结直肠癌中的甲基化状态及其功能研究
发布时间：2021-07-20 06:18
目的:结直肠癌是严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率都高居全世界恶性肿瘤的前三位。研究表明,DNA启动子异常甲基化导致的基因表达沉默及其功能改变与结直肠癌的发生发展、免疫逃逸及复发转移密切相关。课题组前期通过全基因组甲基化测序方法筛选出囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic fibrosis transmmembrane conductance regulator,CFTR）的特异性甲基化与结直肠癌淋巴结转移相关,本研究着眼探讨其在结直肠原发癌和淋巴结转移癌中的甲基化水平及其功能。方法:（1）采用全基因组甲基化测序技术对山东大学附属千佛山医院病理科保存的12例结直肠原发癌组织及其对应的淋巴结转移癌组织和正常肠黏膜组织（距原发癌边缘>5cm）进行测序,筛选结果中组间甲基化水平差异倍数Log2FC>|1|且P<0.05的甲基化差异基因;（2）收集70例结直肠癌石蜡组织样本（包括12例测序所用样本）利用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）验证候选基因CFTR启动子甲基化状态,并分析其与临床病理特征的关系;（3）运用免...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１：?ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因组甲基化测序实验原理示意图??图１Ａ：演示酶切及测序过程
??山东大学硕士学位论文???ＧＶ２４８??１｜?—??＼ＺＪ??图２?ＣＦＴＲ过表达慢病毒图谱??３．?７?ＭＴＴ增殖实验??（１）取４块９６孔板，分别标记为０、２４、４８、７２ｈ。收集对数生长期ＨＣＴ１１６和??Ｃａｃｏ－２细胞系，取１８０ｐＬ细胞悬液于９６孔板中，每个孔中的细胞数约为６０００??个，每组中设置３个重复孔，并培养２４ｈ。同时设置相同处理条件的调零孔。??（２）每２４ｈ取出９６孔板，小心吸弃上清液，每孔加入９０汕完全培养基和１０ＭＬ?ＭＴＴ??溶液，继续培养４ｈ。??（３）小心吸出每个孔内的液体，加入ｌｌＯｐｉ?Ｆｏｒｍａｚａｎ溶解液，置于摇床上，低??速震荡ｌＯｍｉｎ，充分溶解结晶物，使用酶标仪测量并记录各孔在４９０ｎｍ处的??吸光值。??（４）以培养时间为横坐标，以所测得的吸光度值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。??３．?８克隆形成实验??（１）用０．２５％胰酶消化处于对数生长期的ＨＣＴ１１６、ＣａＣｏ－２，加入完全培养基，??用力吹打，使细胞分散成单个细胞，梯度稀释细胞悬液，并以适当的细胞浓??度接种在６ｃｍ培养皿中，使得每个孔中的细胞数约为１０００个，接种完后，??轻轻转动培养皿，使细胞分散均匀。??２４??
?山东大学硕Ｌ－学位论文???结果??１．?ＣＦＴＲ基因的筛选??利用ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因组甲基化测序技术对１２例结直肠癌样本（即：原??发癌组织及其对应的淋巴结转移癌组织和正常肠粘膜组织）进行检测，筛选测序??结果中组间差异Ｚ５值彡〇．〇５且Ｌｏｇ＿．ＦＣ＞ｌ的候选基因。结果显示，结直肠癌组织??及淋巴结转移癌组织中ＣＦＴＲ甲基化水ｆ均髙丁？正常肠黏膜组织（产〇．?００４，??Ｌｏｇ２ＦＣ＝４．４１３），见图?３。??１０?０．?Ｉ?？??７?５?■?｜｜??ｏ＇?？丨：??Ｉ?：?：??〇?５?０－?．！?！?？?？?Ｒｅｇｕｌａｔｅ??■＊￣?？?｜?｜?？??〇?？?？?？?？?ｄｏｗｎ??丁?？?？?＊?？??參?？?？?Ｉ?Ｉ?？?？?ｎｏ?ｃｈａｎｇｅｄ??？?？，?１?？?ｕｐ??ｒ．?？：＊?；?－＊．?？?？??．？?？？？？?？：、“：?１，?＊＊?，?：?ＣＦＴ－Ｒ－?？??？?？？：?？?．＊：＇淡ａ??……??Ｏ?？??５?０?５??ｌｏｇ２（ＦＣ）??图３甲基化差异基因ＣＦＴＲ的筛选??注：Ｌｏｇ」ＦＣ＞０代表在结直肠癌肿瘤组织中发生高甲基化，Ｌｏｇ：ＦＣ＜０代表在结直??肠癌肿瘤组织屮发生低甲基化。??２．?ＣＦＴＲ在人类结直肠癌中频繁发生甲基化??选取７０例正常结直肠黏膜组织及对应的癌组织进行ＭＳＰ实验，结汜品小？，??两者中ＣＦＴＲ启动子甲基化率分别为４１．４％（２９／７０）和６２．２％（４５／７０），部分结果??２７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]结直肠癌组织ZNF655基因启动子甲基化状态及其临床意义[J]. 宋超,郭晓红,孙青. 中华肿瘤防治杂志. 2019(17)
[2]中美结直肠癌流行病学特征对比及防控策略分析[J]. 王锡山. 中华结直肠疾病电子杂志. 2019(01)
[3]2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J]. 郑荣寿,孙可欣,张思维,曾红梅,邹小农,陈茹,顾秀瑛,魏文强,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2019 (01)
[4]血浆SEPT9基因甲基化监测结直肠癌术后复发转移的应用价值[J]. 张姗,房春芳,丁洁,付波,陈双峰,焉鹏. 中国肿瘤临床. 2018(15)
[5]卵巢癌组织SEMA3F表达及甲基化初步研究[J]. 裴雪阳,徐云钊,谭细娟,叶青,奚庆华. 中华肿瘤防治杂志. 2014(20)
[6]结直肠癌转移机制研究进展[J]. 赵亮,丁彦青. 浙江大学学报(医学版). 2014 (04)
[7]Molecular biomarkers for the detection of metastatic colorectal cancer cells[J]. Hidenori Kamiyama,Hiroshi Noda,Fumio Konishi,Toshiki Rikiyama. World Journal of Gastroenterology. 2014(27)
[8]Advances in epigenetic biomarker research in colorectal cancer[J]. Xi Wang,Ye-Ye Kuang,Xiao-Tong Hu. World Journal of Gastroenterology. 2014(15)
[9]DNA甲基化及检测方法研究进展[J]. 李媛媛,龚晓,包云飞,洪亚辉. 湖南农业科学. 2010(13)
[10]基于PCR技术的DNA甲基化检测方法研究进展[J]. 李克勇,肖武生,常秀丽,吴庆. 国外医学(卫生学分册). 2008(05)
本文编号：3292308
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１：?ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因组甲基化测序实验原理示意图??图１Ａ：演示酶切及测序过程
??山东大学硕士学位论文???ＧＶ２４８??１｜?—??＼ＺＪ??图２?ＣＦＴＲ过表达慢病毒图谱??３．?７?ＭＴＴ增殖实验??（１）取４块９６孔板，分别标记为０、２４、４８、７２ｈ。收集对数生长期ＨＣＴ１１６和??Ｃａｃｏ－２细胞系，取１８０ｐＬ细胞悬液于９６孔板中，每个孔中的细胞数约为６０００??个，每组中设置３个重复孔，并培养２４ｈ。同时设置相同处理条件的调零孔。??（２）每２４ｈ取出９６孔板，小心吸弃上清液，每孔加入９０汕完全培养基和１０ＭＬ?ＭＴＴ??溶液，继续培养４ｈ。??（３）小心吸出每个孔内的液体，加入ｌｌＯｐｉ?Ｆｏｒｍａｚａｎ溶解液，置于摇床上，低??速震荡ｌＯｍｉｎ，充分溶解结晶物，使用酶标仪测量并记录各孔在４９０ｎｍ处的??吸光值。??（４）以培养时间为横坐标，以所测得的吸光度值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。??３．?８克隆形成实验??（１）用０．２５％胰酶消化处于对数生长期的ＨＣＴ１１６、ＣａＣｏ－２，加入完全培养基，??用力吹打，使细胞分散成单个细胞，梯度稀释细胞悬液，并以适当的细胞浓??度接种在６ｃｍ培养皿中，使得每个孔中的细胞数约为１０００个，接种完后，??轻轻转动培养皿，使细胞分散均匀。??２４??
?山东大学硕Ｌ－学位论文???结果??１．?ＣＦＴＲ基因的筛选??利用ＭｅｔｈｙｌＲＡＤ全基因组甲基化测序技术对１２例结直肠癌样本（即：原??发癌组织及其对应的淋巴结转移癌组织和正常肠粘膜组织）进行检测，筛选测序??结果中组间差异Ｚ５值彡〇．〇５且Ｌｏｇ＿．ＦＣ＞ｌ的候选基因。结果显示，结直肠癌组织??及淋巴结转移癌组织中ＣＦＴＲ甲基化水ｆ均髙丁？正常肠黏膜组织（产〇．?００４，??Ｌｏｇ２ＦＣ＝４．４１３），见图?３。??１０?０．?Ｉ?？??７?５?■?｜｜??ｏ＇?？丨：??Ｉ?：?：??〇?５?０－?．！?！?？?？?Ｒｅｇｕｌａｔｅ??■＊￣?？?｜?｜?？??〇?？?？?？?？?ｄｏｗｎ??丁?？?？?＊?？??參?？?？?Ｉ?Ｉ?？?？?ｎｏ?ｃｈａｎｇｅｄ??？?？，?１?？?ｕｐ??ｒ．?？：＊?；?－＊．?？?？??．？?？？？？?？：、“：?１，?＊＊?，?：?ＣＦＴ－Ｒ－?？??？?？？：?？?．＊：＇淡ａ??……??Ｏ?？??５?０?５??ｌｏｇ２（ＦＣ）??图３甲基化差异基因ＣＦＴＲ的筛选??注：Ｌｏｇ」ＦＣ＞０代表在结直肠癌肿瘤组织中发生高甲基化，Ｌｏｇ：ＦＣ＜０代表在结直??肠癌肿瘤组织屮发生低甲基化。??２．?ＣＦＴＲ在人类结直肠癌中频繁发生甲基化??选取７０例正常结直肠黏膜组织及对应的癌组织进行ＭＳＰ实验，结汜品小？，??两者中ＣＦＴＲ启动子甲基化率分别为４１．４％（２９／７０）和６２．２％（４５／７０），部分结果??２７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]结直肠癌组织ZNF655基因启动子甲基化状态及其临床意义[J]. 宋超,郭晓红,孙青. 中华肿瘤防治杂志. 2019(17)
[2]中美结直肠癌流行病学特征对比及防控策略分析[J]. 王锡山. 中华结直肠疾病电子杂志. 2019(01)
[3]2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J]. 郑荣寿,孙可欣,张思维,曾红梅,邹小农,陈茹,顾秀瑛,魏文强,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2019 (01)
[4]血浆SEPT9基因甲基化监测结直肠癌术后复发转移的应用价值[J]. 张姗,房春芳,丁洁,付波,陈双峰,焉鹏. 中国肿瘤临床. 2018(15)
[5]卵巢癌组织SEMA3F表达及甲基化初步研究[J]. 裴雪阳,徐云钊,谭细娟,叶青,奚庆华. 中华肿瘤防治杂志. 2014(20)
[6]结直肠癌转移机制研究进展[J]. 赵亮,丁彦青. 浙江大学学报(医学版). 2014 (04)
[7]Molecular biomarkers for the detection of metastatic colorectal cancer cells[J]. Hidenori Kamiyama,Hiroshi Noda,Fumio Konishi,Toshiki Rikiyama. World Journal of Gastroenterology. 2014(27)
[8]Advances in epigenetic biomarker research in colorectal cancer[J]. Xi Wang,Ye-Ye Kuang,Xiao-Tong Hu. World Journal of Gastroenterology. 2014(15)
[9]DNA甲基化及检测方法研究进展[J]. 李媛媛,龚晓,包云飞,洪亚辉. 湖南农业科学. 2010(13)
[10]基于PCR技术的DNA甲基化检测方法研究进展[J]. 李克勇,肖武生,常秀丽,吴庆. 国外医学(卫生学分册). 2008(05)
本文编号：3292308
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