RNF111通过调控TGF-β/Smad信号通路影响非小细胞肺癌转移的表观机制

发布时间：2021-07-23 03:45

　　背景与目的:由于发病率和死亡率增长最快,肺癌成为对人群身体健康威胁最大的恶性肿瘤之一。而且因为早期诊断技术和后期的有效治疗的缺乏,约占肺癌85%的非小细胞肺癌有着高达86%的死亡率,因此,探索和研究清楚非小细胞肺癌的致病机理则显得尤为重要。DNA的甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一,被认为是最典型导致基因表达或者沉默的机制,大量的研究也表明它与肿瘤的发生发展密切相关。TGF-β信号通路的异常与多种肿瘤的发生和转移有着紧密的联系。RNF111基因编码的蛋白Arkadia可以通过泛素化途径促进TGF-β信号通路中的负调控因子Smad7,SnoN和Ski的降解来增强TGF-β信号通路。本研究主要通过检测RNF111基因在两株非小细胞肺癌95C（低转移）和95D（高转移）中mRNA表达水平,来探索两株细胞株中RNF111的mRNA表达水平的差异与基因启动子区甲基化引起的基因转录调控改变之间潜在的机制。方法:Transwell实验检测95C、95D和A549细胞的迁移和侵袭能力;运用Real-Time PCR和western blot检测2株细胞株（95C和95D）中RNF111基因的表达,... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
引言
    一、非小细胞肺癌
    二、TGF-Β信号通路与肿瘤
    三、表观遗传学
    四、DNA甲基化研究与肿瘤发生发展的关系
    参考文献
一、前言
二、材料和方法
    （一）材料
        1、常用试剂见表 1：
        2、常用试剂的配制：
        3、Amp储液的配制
        4、常用仪器见表 2：
    （二）研究方法与步骤
        1、细胞培养
        2、5-Aza去甲基化药物的溶解
        3、5-Aza去甲基化药物处理细胞
        4、组织/细胞DNA的提取
        5、组织/细胞RNA的提取
        6、DNA的亚硫酸氢盐修饰
        7、Transwell细胞转移和侵袭检测
        8、功能性CpG的位点的筛选
        9、重亚硫酸盐测序PCR（Bisulfite Sequencing PCR, BSP）检测-459CpG位点甲基化频率
        10、PCR产物的T载体克隆
        11、甲基化和非甲基化重组质粒的构建
        12、菌液质粒DNA的抽提
        13、Western Blot
        14、电泳迁移率EMSA
        15、染色质免疫共沉淀ChIP
        16、siRNA瞬时共转染细胞
三、结果
    （一） DNA甲基化影响RNF111的表达
    （二） RNF111基因近端启动子区的-459CPG位点是一个功能性位点
    （三） SP1能够靶向作用于RNF111基因启动子包含-459CPG位点的区域，并且增加RNF111的表达
    （四） RNF111基因-459CPG位点的高甲基化能够降低转录因子的结合能力
    （五）DNA低甲基化导致的RNF111上调对TGF-Β/SMAD信号通路的影响·46
    （六） RNF111增强了TGF-Β/SMAD信号通路的活性和非小细胞肺癌细胞株的转移和侵袭能力
四、讨论
参考文献
致谢



本文编号：3298529