基因转录激活子MeCP2和Rb调控环沉默在氢醌诱发细胞恶变过程中的作用及表观遗传学机制
发布时间：2021-08-10 04:39
1.研究背景DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学修饰（epigenetic modification）在基因转录调节过程起着重要作用,是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件,是近年来生命科学的热门研究领域之一,其中DNA甲基化是研究得最为广泛的表观遗传学修饰。DNA甲基化过程为在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）的作用下,以共价结合的方式给基因组CpG岛中胞嘧啶添加甲基基团的过程。正常的基因组甲基化模式（DNA methylation pattern）保证了细胞进行精确的基因转录调节,后者对于细胞正常功能的发挥起至关重要的作用。然而在基因转录调节过程,DNA甲基化并不是唯一起决定性作用的表观遗传学修饰,众多研究已经表明,DNA甲基化后的甲基结合蛋白（methyl-CpG binding domain protein, MBD）介导的组蛋白修饰在基因转录过程可能发挥的作用比DNA甲基化更为重要。MeCP2 （methyl-CpG binding protein 2）是MBD家族最重要的成员之一,也是潜在的肿瘤临床治疗靶点。大量研究表明,MeCP2是一个...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图４质粒及其酶切鉴定（１？５運组质粒化ＶＸ－ＭＥＣＰｌ？５酶切电泳，Ｍａｒｋｅｒ：５０００ｂｐｍａｒ］ｃｅｒ）??巧ｇｕｒｅ?４，?Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｎｚｍａｔｉｃ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｂｙ?ｅ！ｅｃｔｒｏｐｈｏｉ＊ｅｓｉｓ．??
依次１０倍倍比稀释病毒，即（１〇－３、１０人１〇－５、１〇－６、１０－７），混匀稀释的病毒，??分别加到４８孔中，每孔１００＾１１，３７°Ｃ，?５％（：０２继续培养４８１１。利用巧光倒置显??微镜检测统计各个孔带巧光细胞的数量，计算出病毒的滴度。图５的慢病毒的??滴度约为７．３ｘ１０６。??９．?ＴＫ６细胞ＭＥＣＰ２基因髙表达细胞株的构建??培养ＴＫ６细胞，将约４ｘｌ〇５个ＴＫ６细胞接种于Ｔ２５的细胞培养瓶中，培养??１８?ｈ后，取病毒０．５?ｍＬ并加入ＲＰＭ－１６４０完全培养基，再加入ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ至终??浓度８?＾１３／１１正。去除培养瓶中原有的完全培养基，加入上述含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０??完全培养基。转染２４ｈ后去除含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０完全培养基，加入正常的??ＲＰＭ－１６４０完全培养基再培养２４?ｈ，然后换用１?＾ｌｇ／ｍＬ?Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ对细胞进行筛??选，每隔２?ｄ换液一次，筛选时间为７ｄ。筛选完成后，去除培养瓶中含Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??的完全培养基，加入正常的完全培养基使细胞正常生长。??（十兰）裸鼠体外成瘤实验??ＢＡＬＢ／Ｃ免疫缺陷雌性小鼠从广东省实验动物
为初步鉴定其恶性表型，Ｗ细胞计数法和ＣＣＫ－８试剂盒检测恶性转化细??胞的生长速度。细胞计数法检测结果显示，细胞培养７２?ｈ后，ＨＱ恶性转化细胞??的生长速度是ＰＢＳ正常细胞的３．８５倍（图７Ａ），差异有统计学意义（戶＜０．０５）。??该结果用ＣＣＫ－８细胞活力检测试剂盒进一步证实了（图７Ｂ），差异有统计学意??义（Ｐ＜０．０５）。该结果表明，ＨＱ长时间处理后，细胞生长速度加快，细胞已经??巧步具有肿瘤恶性表型。??Ａ?—?Ｂ??Ａ?含?４．Ｓ］?＊?〇?ＺＳ］?＊??０?３．５－?巧?２．０－??ＰＢＳ?ＨＱ?ＰＢＳ?ＨＱ??图７恶性转化细胞生长速度检测??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｃｅｌｌ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｓｓ巧?ｂｙ?ｃｅｌｌ?ｃｏｕｎｔｉｎｇ?（Ａ）?ｏｒ?ＣＣＫ－８?ｋｉｔ?巧）？?＊?ＶＳ．?ＰＢＳ?尸＜０．０５．??３．恶性转化细胞细胞周期和细胞调亡改变??细胞周期速度加快是肿瘤细胞的另一生物学性状。为进一步鉴定其恶性程??度，用＾％乙醇固定细胞，ＷＰＩ标记细胞后，用流式细胞术，检测恶性转化细??胞细胞周期分布情况。结果显示，恶性转化细胞Ｓ期细胞比例比正常细胞多，??由正常细胞的４１．１％增加到４８．２％?（图８），差异有统计学意义（户＜０．０５）。同时使??用ＰＩ和巧ＴＣ的双标记法流式细胞术对两种细胞的调亡情况进行了分析，结果??表明，两种细胞的调亡率没有明显差别（图９），未见统计学差异（户＞０．０５）。导??致该结果的出现可能是由于没有对细胞进行调亡诱导所致。使用各种细胞调亡??诱导方法对细胞进行诱导
【参考文献】：
期刊论文
[1]Interaction among Rb/p16, Rb/E2F1 and HDAC1 Proteins in Gallbladder Carcinoma[J]. 王欣,黄凯,徐立宁. Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2009(06)
硕士论文
[1]pIRES-GFP-hPENK的构建及其鞘内注射的表达[D]. 李永辉.河南科技大学 2010
[2]反式二羟环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22对PTEN基因调控及其功能研究[D]. 刘林华.广州医学院 2009
本文编号：3333478
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图４质粒及其酶切鉴定（１？５運组质粒化ＶＸ－ＭＥＣＰｌ？５酶切电泳，Ｍａｒｋｅｒ：５０００ｂｐｍａｒ］ｃｅｒ）??巧ｇｕｒｅ?４，?Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｎｚｍａｔｉｃ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｂｙ?ｅ！ｅｃｔｒｏｐｈｏｉ＊ｅｓｉｓ．??
依次１０倍倍比稀释病毒，即（１〇－３、１０人１〇－５、１〇－６、１０－７），混匀稀释的病毒，??分别加到４８孔中，每孔１００＾１１，３７°Ｃ，?５％（：０２继续培养４８１１。利用巧光倒置显??微镜检测统计各个孔带巧光细胞的数量，计算出病毒的滴度。图５的慢病毒的??滴度约为７．３ｘ１０６。??９．?ＴＫ６细胞ＭＥＣＰ２基因髙表达细胞株的构建??培养ＴＫ６细胞，将约４ｘｌ〇５个ＴＫ６细胞接种于Ｔ２５的细胞培养瓶中，培养??１８?ｈ后，取病毒０．５?ｍＬ并加入ＲＰＭ－１６４０完全培养基，再加入ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ至终??浓度８?＾１３／１１正。去除培养瓶中原有的完全培养基，加入上述含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０??完全培养基。转染２４ｈ后去除含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０完全培养基，加入正常的??ＲＰＭ－１６４０完全培养基再培养２４?ｈ，然后换用１?＾ｌｇ／ｍＬ?Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ对细胞进行筛??选，每隔２?ｄ换液一次，筛选时间为７ｄ。筛选完成后，去除培养瓶中含Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??的完全培养基，加入正常的完全培养基使细胞正常生长。??（十兰）裸鼠体外成瘤实验??ＢＡＬＢ／Ｃ免疫缺陷雌性小鼠从广东省实验动物
为初步鉴定其恶性表型，Ｗ细胞计数法和ＣＣＫ－８试剂盒检测恶性转化细??胞的生长速度。细胞计数法检测结果显示，细胞培养７２?ｈ后，ＨＱ恶性转化细胞??的生长速度是ＰＢＳ正常细胞的３．８５倍（图７Ａ），差异有统计学意义（戶＜０．０５）。??该结果用ＣＣＫ－８细胞活力检测试剂盒进一步证实了（图７Ｂ），差异有统计学意??义（Ｐ＜０．０５）。该结果表明，ＨＱ长时间处理后，细胞生长速度加快，细胞已经??巧步具有肿瘤恶性表型。??Ａ?—?Ｂ??Ａ?含?４．Ｓ］?＊?〇?ＺＳ］?＊??０?３．５－?巧?２．０－??ＰＢＳ?ＨＱ?ＰＢＳ?ＨＱ??图７恶性转化细胞生长速度检测??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｃｅｌｌ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｓｓ巧?ｂｙ?ｃｅｌｌ?ｃｏｕｎｔｉｎｇ?（Ａ）?ｏｒ?ＣＣＫ－８?ｋｉｔ?巧）？?＊?ＶＳ．?ＰＢＳ?尸＜０．０５．??３．恶性转化细胞细胞周期和细胞调亡改变??细胞周期速度加快是肿瘤细胞的另一生物学性状。为进一步鉴定其恶性程??度，用＾％乙醇固定细胞，ＷＰＩ标记细胞后，用流式细胞术，检测恶性转化细??胞细胞周期分布情况。结果显示，恶性转化细胞Ｓ期细胞比例比正常细胞多，??由正常细胞的４１．１％增加到４８．２％?（图８），差异有统计学意义（户＜０．０５）。同时使??用ＰＩ和巧ＴＣ的双标记法流式细胞术对两种细胞的调亡情况进行了分析，结果??表明，两种细胞的调亡率没有明显差别（图９），未见统计学差异（户＞０．０５）。导??致该结果的出现可能是由于没有对细胞进行调亡诱导所致。使用各种细胞调亡??诱导方法对细胞进行诱导
【参考文献】：
期刊论文
[1]Interaction among Rb/p16, Rb/E2F1 and HDAC1 Proteins in Gallbladder Carcinoma[J]. 王欣,黄凯,徐立宁. Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2009(06)
硕士论文
[1]pIRES-GFP-hPENK的构建及其鞘内注射的表达[D]. 李永辉.河南科技大学 2010
[2]反式二羟环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22对PTEN基因调控及其功能研究[D]. 刘林华.广州医学院 2009
本文编号：3333478
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3333478.html
