DNA甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌血清样本的应用
发布时间：2021-08-12 02:50
乳腺癌的高发病率严重影响我国妇女的身心健康,而早发现并及时治疗可以降低其带来的死亡率。研究表明,基因启动子区域是否存在被甲基化,可以成为早期筛查乳腺癌的重要生物学指标。随着“液态活检”技术的快速发展,发现监测游离DNA的甲基化水平对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。因此,本文建立了一种一体化评估乳腺癌患者血清样本中DNA甲基化的方法,为乳腺癌早期诊断提供新思路。1、针对血清样本,优化了一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒,包括磁珠用量,核酸助沉剂的量等,并进行了一系列性能测试,如试剂盒的稳定性测试和回收率测试。结果显示,该试剂盒稳定性好,其核酸的回收率也在90%以上。同时,其对真实样本有着相同甚至更优于商用柱式法试剂盒的提取效果。最后,实验还优化了该试剂盒的提取步骤,合并了裂解和结合步骤,大大的缩短了核酸提取时间。2、建立了一种重组酶介导链替换核酸扩增技术（RAA）荧光检测SNRPN基因甲基化的新方法。实验主要包括筛选RAA荧光检测方法所需的引物与探针,并经过一系列优化,包括反应时间和反应温度,最终得到了最优的体系。然后,通过合成了一段标准的甲基化模板,用于甲基化基因定量曲线的绘制。实验结果...
【文章来源】：湖南工业大学湖南省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
磁珠法提取核酸的过程原理图
硕士学位论文3在高盐浓度与低pH值的条件下，溶液中的羟基磁珠会与核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其他杂质（如蛋白、糖类）结合，迅速从生物样品中捕获到核酸。而在低盐浓度和高pH值的条件下，羟基磁珠会与结合的核酸分离，从而达到释放核酸的目的。利用磁珠法提取试剂盒来纯化样本中的核酸，其最大优点就是可以自动化。整个提取过程在有磁场条件下磁珠可以发生定向的聚集或分散，从而可减少需离心等手工操作的使用。磁珠法是也目前应用最为广泛的一种核酸提取方法，其能实现自动化提取核酸，大大提高了工作效率。其提取流程如图1-1所示：将血清样本做简单处理，然后经过裂解步骤-结合步骤-洗脱步骤，最后得到纯化后的核酸。表1-1内列举了国内外部分磁珠法提取游离DNA试剂盒的产品信息。表1-1磁珠法提取游离DNA试剂盒的产品信息Table1-1Productinformationofmagneticbeadscell-freeDNAextractionkit厂家产品名称样本类型样本体积产率海狸BeaverBeadsCirculatingDNAKit血清、血浆等0.2-5mL85%ThermoFisherMagMAXCell-FreeDNA(cfDNA)Isolation血清、血浆、尿液0.5-10mL10–12ng/mL天根生化MagneticSerum/PlasmaDNAKit血浆、血清等0.4-5mL84%ANGENMagPureCirculatingDNAMaxiKit血浆、血清等2-6mL86%柱式法：图1-2柱式法提取核酸的过程原理图Figure1-2Schematicdiagramofnucleicacidextractionbycolumnmethod柱式法是提取游离DNA的高效方法，其可以在较低的样本体积中获得较高的DNA产率。目前，柱式法提取试剂盒中的离心柱主要是以硅胶滤膜作为固相载体，然后基于二氧化硅可选择性结合核酸的独特属性，实现核酸的提取与纯化。
DNA甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌血清样本的应用12图1-3cfMeDIP-seq方法的示意图Figure1-3SchematicrepresentationofthecfMeDIP–seqprotocol1.4重组酶介导等温扩增技术聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛用于专业检测机构的核酸检测技术，但由于这想技术操作复杂、所需仪器昂贵、涉及多重变温过程，所以其并不适用于家庭检测和基层检测。因此，为了克服PCR技术的缺点，等温扩增检测技术引起研究者广泛关注。近十几年来，新型的等温核酸扩增技术得到了飞速的发展，如环介导等温扩增技术67、重组酶聚合酶扩增68、滚环扩增69、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术70等等，被广泛应用于生产生活的各个方面，并且获得了一定的实际应用价值。目前，一种新型的恒温核酸扩增技术-重组酶介导等温扩增（Recombinase-aidamplification,RAA）技术被发展71，并迅速应用于病原体检测、食品成分分析、病毒分析，疾病分析等领域72-75。这种技术的基本原理是：首先由引物、重组酶、单链结合蛋白形成复合体，在引物同源的序列处会使双链的靶DNA解旋，接下来单链结合蛋白（SSB）会与解离的单链DNA结合来防止单链DNA复性，最后在dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶完成链的延伸，该扩增过程可在5-20分钟完成76（如图1-4所示）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]血清游离DNA浓度及完整性在食管癌诊断中的价值[J]. 邱蕴文,申娴娟,金春景,曹兴建,鞠少卿. 中华肿瘤杂志. 2018 (12)
本文编号：3337428
【文章来源】：湖南工业大学湖南省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
磁珠法提取核酸的过程原理图
硕士学位论文3在高盐浓度与低pH值的条件下，溶液中的羟基磁珠会与核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其他杂质（如蛋白、糖类）结合，迅速从生物样品中捕获到核酸。而在低盐浓度和高pH值的条件下，羟基磁珠会与结合的核酸分离，从而达到释放核酸的目的。利用磁珠法提取试剂盒来纯化样本中的核酸，其最大优点就是可以自动化。整个提取过程在有磁场条件下磁珠可以发生定向的聚集或分散，从而可减少需离心等手工操作的使用。磁珠法是也目前应用最为广泛的一种核酸提取方法，其能实现自动化提取核酸，大大提高了工作效率。其提取流程如图1-1所示：将血清样本做简单处理，然后经过裂解步骤-结合步骤-洗脱步骤，最后得到纯化后的核酸。表1-1内列举了国内外部分磁珠法提取游离DNA试剂盒的产品信息。表1-1磁珠法提取游离DNA试剂盒的产品信息Table1-1Productinformationofmagneticbeadscell-freeDNAextractionkit厂家产品名称样本类型样本体积产率海狸BeaverBeadsCirculatingDNAKit血清、血浆等0.2-5mL85%ThermoFisherMagMAXCell-FreeDNA(cfDNA)Isolation血清、血浆、尿液0.5-10mL10–12ng/mL天根生化MagneticSerum/PlasmaDNAKit血浆、血清等0.4-5mL84%ANGENMagPureCirculatingDNAMaxiKit血浆、血清等2-6mL86%柱式法：图1-2柱式法提取核酸的过程原理图Figure1-2Schematicdiagramofnucleicacidextractionbycolumnmethod柱式法是提取游离DNA的高效方法，其可以在较低的样本体积中获得较高的DNA产率。目前，柱式法提取试剂盒中的离心柱主要是以硅胶滤膜作为固相载体，然后基于二氧化硅可选择性结合核酸的独特属性，实现核酸的提取与纯化。
DNA甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌血清样本的应用12图1-3cfMeDIP-seq方法的示意图Figure1-3SchematicrepresentationofthecfMeDIP–seqprotocol1.4重组酶介导等温扩增技术聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛用于专业检测机构的核酸检测技术，但由于这想技术操作复杂、所需仪器昂贵、涉及多重变温过程，所以其并不适用于家庭检测和基层检测。因此，为了克服PCR技术的缺点，等温扩增检测技术引起研究者广泛关注。近十几年来，新型的等温核酸扩增技术得到了飞速的发展，如环介导等温扩增技术67、重组酶聚合酶扩增68、滚环扩增69、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术70等等，被广泛应用于生产生活的各个方面，并且获得了一定的实际应用价值。目前，一种新型的恒温核酸扩增技术-重组酶介导等温扩增（Recombinase-aidamplification,RAA）技术被发展71，并迅速应用于病原体检测、食品成分分析、病毒分析，疾病分析等领域72-75。这种技术的基本原理是：首先由引物、重组酶、单链结合蛋白形成复合体，在引物同源的序列处会使双链的靶DNA解旋，接下来单链结合蛋白（SSB）会与解离的单链DNA结合来防止单链DNA复性，最后在dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶完成链的延伸，该扩增过程可在5-20分钟完成76（如图1-4所示）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]血清游离DNA浓度及完整性在食管癌诊断中的价值[J]. 邱蕴文,申娴娟,金春景,曹兴建,鞠少卿. 中华肿瘤杂志. 2018 (12)
本文编号：3337428
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