miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路抑制膀胱癌T24和EJ细胞的增殖
发布时间：2021-09-28 07:29
目的研究微小RNA-503-5p（miR-503-5p）对膀胱癌T24细胞和EJ细胞生长的影响和机制。方法 T24细胞和EJ细胞转染miR-503-5p模拟物或阴性对照微小RNA（miR-NC）并验证转染效率,生物信息学软件预测miR-503-5p的靶基因。通过荧光实时定量PCR检测miR-503-5p靶基因E2F转录因子3（E2F3）及下游基因mRNA的表达水平,Western blot法检测视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）/E2F信号通路蛋白E2F3、细胞周期蛋白E（cyclin E）、细胞周期蛋白依赖激酶2（CDK2）、Rb和磷酸化的Rb（p-Rb）蛋白水平,流式细胞术检测膀胱癌细胞周期的变化,MTT法和平板克隆形成实验检测膀胱癌细胞的增殖能力。结果转染miR-503-5p模拟物后,膀胱癌细胞中miR-503-5p的水平显著增加。过表达miR-503-5p可明显降低膀胱癌细胞中E2F3mRNA及Rb/E2F信号通路基因的表达水平,将膀胱癌细胞周期阻滞于G0/G1期,膀胱癌细胞的增殖能力明显降低。结论过表达miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路的转导,抑制膀胱癌细胞的增殖。
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2017,33(10)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
转染后各组中miＲ-503-5p表达量检测
、CDK2和p-Ｒb蛋白的表达均明显下调，Ｒb总蛋白表达基本相当，差异无统计学意义(P＞0．05，图3)。表2膀胱癌细胞Ｒb/E2F信号通路分子的mＲNA表达水平(n=4，%，x±s)细胞分组E2F3CyclinECDK2ＲbT24miＲ-NC1．06±0．441．00±0．041．00±0．051．21±0．77miＲ-503-5p0．43±0．12a0．34±0．10b0．65±0．17b1．13±0．60EJmiＲ-NC1．00±0．051．03±0．321．00±0．111．26±0．96miＲ-503-5p0．53±0．15b0．60±0．14a0．65±0．07b1．06±0．38aP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．图3Westernblot法检测Ｒb/E2F信号通路蛋白表达情况2．5过表达miＲ-503-5p的T24细胞和EJ细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期与对照组相比，过表达miＲ-503-5p后，T24和EJ细胞位于G0/G1期的细胞比例显著上升，S期和G2期细胞比例明显下降(P＜0．05，表3)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞周期的进展。表3miＲ-503-5p对膀胱癌细胞周期的影响(n=4，%，x±s)细胞分组G0/G1SG2/MT24miＲ-NC45．2±3．3835．18±2．6319．61±1．52miＲ-503-5p63．25±4．86b25．17±1．93b11．58±2．93bEJmiＲ-NC48．77±9．0832．55±6．0618．67±3．21miＲ-503-5p65．29±5．58a22．17±1．89a12．54±3．72aaP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．2．6过表达miＲ-503-5p抑制T24细胞和EJ细胞的增殖与对照组相比(图4)，过表达miＲ-503-5p后，T24细胞由第5天开始增殖能力明显下降(P＜0．05)，EJ细胞由第3天开始增殖能力明显下降，差异有统计学意义(P＜0．05)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞的增殖能力。1362细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2017，33(10)
aP＜0．05vsmiＲ-NC．图4MTT检测各组膀胱癌细胞增殖情况2．7过表达miＲ-503-5p抑制T24细胞和EJ细胞的集落形成能力与对照组相比，过表达miＲ-503-5p后，T24和EJ细胞形成的克隆数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0．05，图5)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞的集落形成能力。aP＜0．05vsmiＲ-NC．图5集落形成实验检测各组膀胱癌细胞增殖能力3讨论miＲNA是一类内源性的非编码ＲNA，通过与靶基因mＲNA3'非翻译区(3'-untranslatedregion，3'UTＲ)相结合，可引起靶基因mＲNA的降解或者抑制其翻译，属于转录后水平的调节［10－12］。miＲNA广泛参与机体多种细胞功能如增殖、分化、衰老、凋亡等的变化，引起机体多种生理和病理改变，并且与多种肿瘤的发生发展密切相关［13－14］。近年来，miＲNA已成为疾病分子研究的热点［15－16］。miＲ-503-5p是一种新发现的具有肿瘤抑制作用的miＲNA，可显著抑制乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等多种肿瘤的生长［17－20］。然而，miＲ-503-5p对膀胱癌细胞生长的影响未见报道。我们通过miＲNA靶基因预测网站TargetScan和microＲNA．org，并参考文献报道［20］，确定E2F3基因为miＲ-503-5p的靶基因。E2F3基因属于转录因子E2F家族，具有促进细胞由G0/G1向S期转换的作用，参与细胞周期的调控［21－23］。有研究表明，E2F3基因在膀胱癌组织中呈现高表达［24］，通过干扰E2F3基因的表达抑制膀胱癌的发生发展具有重要的研究意义。本研究发现转染miＲ-503-5p至膀胱癌细胞后，E2F3基因的表达水平显著下调，表明miＲ-503-5p可显著抑制E2F3基因的表达。E2F3基因通过激活下游蛋白cyclinE的表达，使得cyclinE-CDK2激酶复合物形成增加，导致
本文编号：3411491
【文章来源】：细胞与分子免疫学杂志. 2017,33(10)北大核心CSCD
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【部分图文】：
转染后各组中miＲ-503-5p表达量检测
、CDK2和p-Ｒb蛋白的表达均明显下调，Ｒb总蛋白表达基本相当，差异无统计学意义(P＞0．05，图3)。表2膀胱癌细胞Ｒb/E2F信号通路分子的mＲNA表达水平(n=4，%，x±s)细胞分组E2F3CyclinECDK2ＲbT24miＲ-NC1．06±0．441．00±0．041．00±0．051．21±0．77miＲ-503-5p0．43±0．12a0．34±0．10b0．65±0．17b1．13±0．60EJmiＲ-NC1．00±0．051．03±0．321．00±0．111．26±0．96miＲ-503-5p0．53±0．15b0．60±0．14a0．65±0．07b1．06±0．38aP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．图3Westernblot法检测Ｒb/E2F信号通路蛋白表达情况2．5过表达miＲ-503-5p的T24细胞和EJ细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期与对照组相比，过表达miＲ-503-5p后，T24和EJ细胞位于G0/G1期的细胞比例显著上升，S期和G2期细胞比例明显下降(P＜0．05，表3)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞周期的进展。表3miＲ-503-5p对膀胱癌细胞周期的影响(n=4，%，x±s)细胞分组G0/G1SG2/MT24miＲ-NC45．2±3．3835．18±2．6319．61±1．52miＲ-503-5p63．25±4．86b25．17±1．93b11．58±2．93bEJmiＲ-NC48．77±9．0832．55±6．0618．67±3．21miＲ-503-5p65．29±5．58a22．17±1．89a12．54±3．72aaP＜0．05，bP＜0．01vsmiＲ-NC．2．6过表达miＲ-503-5p抑制T24细胞和EJ细胞的增殖与对照组相比(图4)，过表达miＲ-503-5p后，T24细胞由第5天开始增殖能力明显下降(P＜0．05)，EJ细胞由第3天开始增殖能力明显下降，差异有统计学意义(P＜0．05)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞的增殖能力。1362细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2017，33(10)
aP＜0．05vsmiＲ-NC．图4MTT检测各组膀胱癌细胞增殖情况2．7过表达miＲ-503-5p抑制T24细胞和EJ细胞的集落形成能力与对照组相比，过表达miＲ-503-5p后，T24和EJ细胞形成的克隆数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0．05，图5)，提示miＲ-503-5p可抑制膀胱癌细胞的集落形成能力。aP＜0．05vsmiＲ-NC．图5集落形成实验检测各组膀胱癌细胞增殖能力3讨论miＲNA是一类内源性的非编码ＲNA，通过与靶基因mＲNA3'非翻译区(3'-untranslatedregion，3'UTＲ)相结合，可引起靶基因mＲNA的降解或者抑制其翻译，属于转录后水平的调节［10－12］。miＲNA广泛参与机体多种细胞功能如增殖、分化、衰老、凋亡等的变化，引起机体多种生理和病理改变，并且与多种肿瘤的发生发展密切相关［13－14］。近年来，miＲNA已成为疾病分子研究的热点［15－16］。miＲ-503-5p是一种新发现的具有肿瘤抑制作用的miＲNA，可显著抑制乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等多种肿瘤的生长［17－20］。然而，miＲ-503-5p对膀胱癌细胞生长的影响未见报道。我们通过miＲNA靶基因预测网站TargetScan和microＲNA．org，并参考文献报道［20］，确定E2F3基因为miＲ-503-5p的靶基因。E2F3基因属于转录因子E2F家族，具有促进细胞由G0/G1向S期转换的作用，参与细胞周期的调控［21－23］。有研究表明，E2F3基因在膀胱癌组织中呈现高表达［24］，通过干扰E2F3基因的表达抑制膀胱癌的发生发展具有重要的研究意义。本研究发现转染miＲ-503-5p至膀胱癌细胞后，E2F3基因的表达水平显著下调，表明miＲ-503-5p可显著抑制E2F3基因的表达。E2F3基因通过激活下游蛋白cyclinE的表达，使得cyclinE-CDK2激酶复合物形成增加，导致
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