钙激活氯通道TMEM16A/ANO1在肝癌中低表达的可能机制及其对细胞增殖的影响
发布时间：2021-10-08 08:26
目的:本实验拟1、研究肝癌组织、癌旁组织和良性肝组织中TMEM16A蛋白水平的表达差异,在肝癌组织和癌旁组织中研究TMEM16Am RNA水平表达差异;2、在肝癌细胞系SMMC-7721中转入TMEM16A过表达质粒并研究TMEM16A过表达对肝脏肿瘤细胞的增殖能力、迁移能力和凋亡能力的影响。3、研究肝癌组织和癌旁组织的TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化药物5-氮杂-2脱氧胞苷处理对TMEM16A蛋白表达水平和TMEM16Am RNA表达水平的影响。方法:1、本课题收集青岛大学附属医院肝胆胰外科40例肝癌切除术患者的肝癌组织及其癌旁组织40对和6例肝良性病变,利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌组织、癌旁组织和肝脏良性组织中的表达水平,利用实时荧光定量PCR方法研究TMEM16Am RNA在肝癌组织和癌旁组织中表达水平;2、通过在肝癌细胞系SMMC-7721中转入TMEM16A过表达质粒p EGFP-TMEM16A和pc DNA3.1-TMEM16A和相应对照空载p EGFP-N1和pc DNA3.1,使用MTT比色...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TMEM16A在肝癌中低表达AWesternblot检测TMEM16A蛋白在肝组织中的表达
为了研究 TMEM16A 在肝癌细胞中对细胞功能的影响，我们首先研究 SMM721 中 TMEM16A 蛋白表达水平，已有学者发现 TMEM16A 在乳腺癌组织和乳细胞系 MDA-MB-231 中高表达[17]。通过 western blot 我们比较了 SMMC-7721 和DA-MB-231 中 TMEM16A 蛋白表达水平，我们发现相比于乳腺癌细胞 SMMC-细胞的 TMEM16A 明显低表达（图 2A）。我们利用 Lipofectamine 3000 对肝癌系 SMMC-7721 进行 pEGFP-TMEM16A 和 pcDNA3.1-TMEM16A 或相应空载 pP-N1 和 pcDNA3.1 质粒转染。使用实时荧光定量 PCR（n=5，相对 mRNA 表达倍SMMC-7721 vs pcDNA3.1 vs pcDNA3.1- TMEM16A， 1±0 vs 1.236±0.0983 v3.219±387.947，p＜0.001；n=5，SMMC-7721 vs pEGFP-N1 vs pEGFP-TMEM11±0 vs 1.520±0.223 vs 1563.587±590.934，p＜0.001，图 2B）和 western blot2C）检测 SMMC-7721 转染质粒后 TMEM16A 的表达。在转染 pEGFP-TMEM和相应空载 0、24 和 48 小时后进行 MTT 实验和划痕实验。MTT 实验结果表明染 pEGFP-TMEM16A 的 SMMC-7721 细胞增殖受到明显抑制 (n=18，490nmOD1.473±0.022 vs 1.333±0.027，p＜0.001，图 3A）。但是划痕实验显示 TMEM16过表达并没有对细胞的迁移产生明显改变（图 3B）。
图 3. TMEM16A 在 SMMC-7721 细胞中过表达抑制细胞增殖A. MTT 实验显示转染 pEGFP-TMEM16A48 小时后，SMMC-7721 细胞的增殖能力明显减弱。1指示 pEGFP-N1 转染；2 指示 pEGFP-TMEM16A 转染。B.划痕实验显示转染 pEGFP-TMEM16A后，细胞迁移能力无明显改变。放大倍数 200；图中黑线镜下长度为 20 微米。3 TMEM16A 的过表达引起肝癌细胞系 SMMC-7721 的凋亡。在实验中我们发现 TMEM16A 表达质粒显著地改变了细胞的形态，异常细胞呈现变圆皱缩等类似凋亡的形态（图 24A），我们在转染后 24、48 和 72 小时后分别随机拍照空载和过表达组细胞图片各 10 张并且对异常细胞计数并统计异常细胞所占百分比，我们发现 TMEM16A 表达质粒使异常细胞百分比明显提高，差异具有统计学意义（n=10，p＜0.001，图 4B）。我们推测 TMEM16A 过表达可能具有促进凋亡的作用。为了验证这一推测，我们使用 Lipofectamine 3000 在 SMMC-7721 细胞中转入 pcDNA3.1 和 pcDNA3.1-TMEM16A 质粒，转染 24 小时后我们通过流式细胞仪进行 Annexin V-FITC 和 PI 双染凋亡检测。同时为了排除 Lipofectamine 3000 可能的细胞毒性干扰我们还检验了不加入质粒但加入同等量 Lipofectamine 3000 的空
【参考文献】：
期刊论文
[1]Epigenetics in hepatocellular carcinoma: An update and future therapy perspectives[J]. Li Ma,Mei-Sze Chua,Ourania Andrisani,Samuel So. World Journal of Gastroenterology. 2014(02)
[2]中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 陈万青,张思维,曾红梅,郑荣寿,邹小农,赵平,吴良有,李光琳,赫捷. 中国肿瘤. 2014(01)
[3]DNA甲基化的生物信息学研究进展[J]. 凡时财,张学工. 生物化学与生物物理进展. 2009(02)
本文编号：3423795
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TMEM16A在肝癌中低表达AWesternblot检测TMEM16A蛋白在肝组织中的表达
为了研究 TMEM16A 在肝癌细胞中对细胞功能的影响，我们首先研究 SMM721 中 TMEM16A 蛋白表达水平，已有学者发现 TMEM16A 在乳腺癌组织和乳细胞系 MDA-MB-231 中高表达[17]。通过 western blot 我们比较了 SMMC-7721 和DA-MB-231 中 TMEM16A 蛋白表达水平，我们发现相比于乳腺癌细胞 SMMC-细胞的 TMEM16A 明显低表达（图 2A）。我们利用 Lipofectamine 3000 对肝癌系 SMMC-7721 进行 pEGFP-TMEM16A 和 pcDNA3.1-TMEM16A 或相应空载 pP-N1 和 pcDNA3.1 质粒转染。使用实时荧光定量 PCR（n=5，相对 mRNA 表达倍SMMC-7721 vs pcDNA3.1 vs pcDNA3.1- TMEM16A， 1±0 vs 1.236±0.0983 v3.219±387.947，p＜0.001；n=5，SMMC-7721 vs pEGFP-N1 vs pEGFP-TMEM11±0 vs 1.520±0.223 vs 1563.587±590.934，p＜0.001，图 2B）和 western blot2C）检测 SMMC-7721 转染质粒后 TMEM16A 的表达。在转染 pEGFP-TMEM和相应空载 0、24 和 48 小时后进行 MTT 实验和划痕实验。MTT 实验结果表明染 pEGFP-TMEM16A 的 SMMC-7721 细胞增殖受到明显抑制 (n=18，490nmOD1.473±0.022 vs 1.333±0.027，p＜0.001，图 3A）。但是划痕实验显示 TMEM16过表达并没有对细胞的迁移产生明显改变（图 3B）。
图 3. TMEM16A 在 SMMC-7721 细胞中过表达抑制细胞增殖A. MTT 实验显示转染 pEGFP-TMEM16A48 小时后，SMMC-7721 细胞的增殖能力明显减弱。1指示 pEGFP-N1 转染；2 指示 pEGFP-TMEM16A 转染。B.划痕实验显示转染 pEGFP-TMEM16A后，细胞迁移能力无明显改变。放大倍数 200；图中黑线镜下长度为 20 微米。3 TMEM16A 的过表达引起肝癌细胞系 SMMC-7721 的凋亡。在实验中我们发现 TMEM16A 表达质粒显著地改变了细胞的形态，异常细胞呈现变圆皱缩等类似凋亡的形态（图 24A），我们在转染后 24、48 和 72 小时后分别随机拍照空载和过表达组细胞图片各 10 张并且对异常细胞计数并统计异常细胞所占百分比，我们发现 TMEM16A 表达质粒使异常细胞百分比明显提高，差异具有统计学意义（n=10，p＜0.001，图 4B）。我们推测 TMEM16A 过表达可能具有促进凋亡的作用。为了验证这一推测，我们使用 Lipofectamine 3000 在 SMMC-7721 细胞中转入 pcDNA3.1 和 pcDNA3.1-TMEM16A 质粒，转染 24 小时后我们通过流式细胞仪进行 Annexin V-FITC 和 PI 双染凋亡检测。同时为了排除 Lipofectamine 3000 可能的细胞毒性干扰我们还检验了不加入质粒但加入同等量 Lipofectamine 3000 的空
【参考文献】：
期刊论文
[1]Epigenetics in hepatocellular carcinoma: An update and future therapy perspectives[J]. Li Ma,Mei-Sze Chua,Ourania Andrisani,Samuel So. World Journal of Gastroenterology. 2014(02)
[2]中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 陈万青,张思维,曾红梅,郑荣寿,邹小农,赵平,吴良有,李光琳,赫捷. 中国肿瘤. 2014(01)
[3]DNA甲基化的生物信息学研究进展[J]. 凡时财,张学工. 生物化学与生物物理进展. 2009(02)
本文编号：3423795
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