14-3-3σ在低氧下通过泛素蛋白酶体途径调控结肠癌中HIF1α蛋白表达
发布时间：2021-10-10 21:46
[目 的]通过体外实验探究低氧条件下14-3-3σ蛋白对肿瘤促进因子——低氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α）蛋白的调控作用并初步探求其分子机制;[方法]1.通过生物信息学分析14-3-3σ在结肠癌中的表达情况及对结肠癌患者生存预后的影响,通过Western blotting验证14-3-3σ在结肠癌细胞系中的表达情况;2.通过Western blotting方法筛选低氧下能稳定诱导表达HIF1α蛋白的结肠癌细胞株;3.在筛选出的结肠癌细胞株DLD1及HCT15中转染14-3-3σ过表达质粒（pCMV5-FLAG-14-3-3σ）,经低氧刺激后通过qRT-PCR及Western blotting方法分别在mRNA及蛋白水平验证其对HIF1α调控作用;使用14-3-3σ的敲低质粒（pLKO.1-shSFN）包装成慢病毒对结肠癌细胞DLD1进行感染,反向验证敲低14-3-3σ后对HIF1α蛋白的调控作用;4.低氧条件下在14-3-3σ过表达DLD1细胞株中使用蛋白稳定性测定实验检测其对HIF1α蛋白稳定性的影响;通过体外泛素化蛋白纯化方法检测...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?１４－３－３ａ在结肠癌中低表达??Ａ．?ＴＣＧＡ数据库中ＳＦｔＶ在结肠癌中的表达；Ｂ．?１４－３－３ａ蛋白在结肠癌细胞中表??
０＆ｒａｗ＝ｓｆｎ＆ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｍＲＮＡ）。我们根据ＳｆＴＶ表达情况将患者分为“高、中、低”??三个部分，将表达量最高的前３３．３％患者定义为“ＳＦＡＡ高表达”，反之后３３．３％??患者定义为“ＳｆＴＶ低表达”。如图１－２所示，虽然表达量差异在短期内对患??者的生存预后并无较大影响，但随着时间进展ＳＦｉＶ表达量较高的ＣＲＣ患者显示??出更好生存与预后，提示１４－３－３ａ低表达与结肠癌患者的不良预后相关。??－ｎｌ＝°ｉＷ４ｓ?－ｎｈＪ？：ｓ??Ｌｏｇｒａｎｋ?ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．１２８??ｌ?６０－?—｜??ｌ????４０－?Ｉ???２０－??〇－＊！?ｊ?ｔ?ｆ?ｊ?ｊ??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００??Ｄａｙｓ??图１－２?１４－３－３（１低表达与结肠癌患者不良预后相关??所以，本部分通过生物信息学和细胞学数据证实了?１４－３－３ＣＪ蛋白在ＣＲＣ中??呈低表达状态，这种低表达或与其基因的表达量下降有关。且的低表达与??结肠癌患者不良预后相关，提示１４－３－３（７在ＣＲＣ的发生发展中发挥了一定的作??用，是ＣＲＣ相关的癌症抑制蛋白。??２?低氧可稳定诱导ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５结肠癌细胞中ＨＩＦｌａ的表达??ＨＩＦｌａ由于其本身特性，在常氧下一般不表达或表达量很少［３８１且查阅文献??可知结肠癌细胞株对低氧环境的敏感性有差异，可能影响ＨＩＦｌａ的蛋白表达量。??为了更好探宄结肠癌中１４－３－３０与ＨＩＦｌａ表达之间的关系，我们使用实验室现有??的６株贴壁培养的结肠癌细胞对低氧下可稳定表达ＨＩＦｌａ的细胞进行了筛眩??将生长至８０
感，其ＨＩＦｌａ表达在２小时内达到峰值，我们细化了低氧暴露时间点，在２小??时内测量４个时间点下的ＨＩＦｌａ表达量。如图２Ｂ所示，ＤＬＤ１和ＨＣＴ１５在短时??间低氧暴露下表现出更明显的积累，所以我们使用这两株细胞在短时间的低氧暴??露条件下进行后续实验。??Ａ???ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）??１４－３－３ａ?卜■＿?峰］２５ｋ〇ａ?１４－３－３ａ?ｌ?？?？？?一?３?２５?ｋＤａ??ＨＩＦｌａ?－?＿１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?？感?＿１〇〇?ｋＤａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?＾ｈｍｂｂｍｂｗｍｈ＾?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?麵義＿．．够．－５０?ｋＤａ??Ｂ?ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?？?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）??ＨＩＦｌａ?－?ＷＢ?ｍｍ?１－１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?｜?ｉ〇〇?｜＜Ｄａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?－?５０?ｋＤａ??图２低氧可稳定诱导ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达??Ａ．长期低氧刺激后ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达；Ｂ．急性低氧刺激后??ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达??３?１４－３－３〇在低氧下抑制ＣＲＣ细胞内ＨＩＦｌａ表达??３．１过表达１４－３－３〇在低氧情况下抑制ＣＲＣ细胞内ＨＩＦｌａ表达??我们使用丨４－３－３〇的过表达质粒ｐＣＭＶ５－ＦＬＡＧ－１４－３－３ｏ构建１４－３－３ａ过表达??Ｃ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Interaction of 14-3-3σ with KCMF1 suppresses the proliferation and colony formation of human colon cancer stem cells[J]. Jian Zou,Lin Mi,Xiao-Feng Yu,Jie Dong. World Journal of Gastroenterology. 2013(24)
[2]The crystal structure of the non-liganded 14-3-3σ protein: insights into determinants of isoform specific ligand binding and dimerization[J]. Anne BENZINGER,Grzegorz M. POPOWICZ,Joma K. JOY,Sudipta MAJUMDAR,Tad A. HOLAK,Heiko HERMEKING. Cell Research. 2005(04)
[3]14-3-3 proteins—an update[J]. Paulette MHAWECH. Cell Research. 2005(04)
[4]Expression and significance of PTEN, hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma[J]. Ying-An Jiang He-Sheng Lua Department of Gastroenterology, Renming Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, ChinaLi-Fang Fan Zhi-Jiao Tang Dong Xia Ming Wang Department of Pathology, Medical College of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, ChinaChong-Qing Jiang Department of Surgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China You-Yuan Zhang Department of Pathology, Central Hospital of Huangshi City, Huangshi 435000, Hubei Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2003(03)
本文编号：3429208
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?１４－３－３ａ在结肠癌中低表达??Ａ．?ＴＣＧＡ数据库中ＳＦｔＶ在结肠癌中的表达；Ｂ．?１４－３－３ａ蛋白在结肠癌细胞中表??
０＆ｒａｗ＝ｓｆｎ＆ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｍＲＮＡ）。我们根据ＳｆＴＶ表达情况将患者分为“高、中、低”??三个部分，将表达量最高的前３３．３％患者定义为“ＳＦＡＡ高表达”，反之后３３．３％??患者定义为“ＳｆＴＶ低表达”。如图１－２所示，虽然表达量差异在短期内对患??者的生存预后并无较大影响，但随着时间进展ＳＦｉＶ表达量较高的ＣＲＣ患者显示??出更好生存与预后，提示１４－３－３ａ低表达与结肠癌患者的不良预后相关。??－ｎｌ＝°ｉＷ４ｓ?－ｎｈＪ？：ｓ??Ｌｏｇｒａｎｋ?ｐ－ｖａｌｕｅ＝０．１２８??ｌ?６０－?—｜??ｌ????４０－?Ｉ???２０－??〇－＊！?ｊ?ｔ?ｆ?ｊ?ｊ??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００??Ｄａｙｓ??图１－２?１４－３－３（１低表达与结肠癌患者不良预后相关??所以，本部分通过生物信息学和细胞学数据证实了?１４－３－３ＣＪ蛋白在ＣＲＣ中??呈低表达状态，这种低表达或与其基因的表达量下降有关。且的低表达与??结肠癌患者不良预后相关，提示１４－３－３（７在ＣＲＣ的发生发展中发挥了一定的作??用，是ＣＲＣ相关的癌症抑制蛋白。??２?低氧可稳定诱导ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５结肠癌细胞中ＨＩＦｌａ的表达??ＨＩＦｌａ由于其本身特性，在常氧下一般不表达或表达量很少［３８１且查阅文献??可知结肠癌细胞株对低氧环境的敏感性有差异，可能影响ＨＩＦｌａ的蛋白表达量。??为了更好探宄结肠癌中１４－３－３０与ＨＩＦｌａ表达之间的关系，我们使用实验室现有??的６株贴壁培养的结肠癌细胞对低氧下可稳定表达ＨＩＦｌａ的细胞进行了筛眩??将生长至８０
感，其ＨＩＦｌａ表达在２小时内达到峰值，我们细化了低氧暴露时间点，在２小??时内测量４个时间点下的ＨＩＦｌａ表达量。如图２Ｂ所示，ＤＬＤ１和ＨＣＴ１５在短时??间低氧暴露下表现出更明显的积累，所以我们使用这两株细胞在短时间的低氧暴??露条件下进行后续实验。??Ａ???ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?１?２?４?６?８?（ｈｒ）??１４－３－３ａ?卜■＿?峰］２５ｋ〇ａ?１４－３－３ａ?ｌ?？?？？?一?３?２５?ｋＤａ??ＨＩＦｌａ?－?＿１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?？感?＿１〇〇?ｋＤａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?＾ｈｍｂｂｍｂｗｍｈ＾?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?麵義＿．．够．－５０?ｋＤａ??Ｂ?ＤＬＤ１?ＨＣＴ１５??Ｈｙｐｏｘｉａ?？?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）?Ｈｙｐｏｘｉａ?－?３０?６０?９０?１２０?（ｍｉｎ）??ＨＩＦｌａ?－?ＷＢ?ｍｍ?１－１００?ｋＤａ?ＨＩＦｌａ?｜?ｉ〇〇?｜＜Ｄａ??ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?■?５０?ｋＤａ?ａ－Ｔｕｂｕｌｉｎ?－?５０?ｋＤａ??图２低氧可稳定诱导ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达??Ａ．长期低氧刺激后ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达；Ｂ．急性低氧刺激后??ＤＬＤ１及ＨＣＴ１５细胞中ＨＩＦｌａ的表达??３?１４－３－３〇在低氧下抑制ＣＲＣ细胞内ＨＩＦｌａ表达??３．１过表达１４－３－３〇在低氧情况下抑制ＣＲＣ细胞内ＨＩＦｌａ表达??我们使用丨４－３－３〇的过表达质粒ｐＣＭＶ５－ＦＬＡＧ－１４－３－３ｏ构建１４－３－３ａ过表达??Ｃ
【参考文献】：
期刊论文
[1]Interaction of 14-3-3σ with KCMF1 suppresses the proliferation and colony formation of human colon cancer stem cells[J]. Jian Zou,Lin Mi,Xiao-Feng Yu,Jie Dong. World Journal of Gastroenterology. 2013(24)
[2]The crystal structure of the non-liganded 14-3-3σ protein: insights into determinants of isoform specific ligand binding and dimerization[J]. Anne BENZINGER,Grzegorz M. POPOWICZ,Joma K. JOY,Sudipta MAJUMDAR,Tad A. HOLAK,Heiko HERMEKING. Cell Research. 2005(04)
[3]14-3-3 proteins—an update[J]. Paulette MHAWECH. Cell Research. 2005(04)
[4]Expression and significance of PTEN, hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma[J]. Ying-An Jiang He-Sheng Lua Department of Gastroenterology, Renming Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, ChinaLi-Fang Fan Zhi-Jiao Tang Dong Xia Ming Wang Department of Pathology, Medical College of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, ChinaChong-Qing Jiang Department of Surgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China You-Yuan Zhang Department of Pathology, Central Hospital of Huangshi City, Huangshi 435000, Hubei Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2003(03)
本文编号：3429208
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