新型雌激素受体GPER1促进EGFR-TKIs耐药的肺癌细胞增殖的研究
发布时间：2021-11-05 20:44
[目的]检测新型雌激素受体GPER1在肺癌细胞中的表达;并进一步探讨GPER1对EGFR-TKIs耐药的肺癌细胞的增殖作用。[方法]运用Q-PCR方法比较GPER1和ERβ在肺癌细胞A549、PC-9和乳腺癌细胞MCF-7（阳性对照）中的表达,并构建对TKIs耐药的肺癌PC9-GR、PC9-OR细胞株,使用PCR及ddPCR法检测构建的耐药细胞株中EGFR突变情况。应用免疫荧光技术检测GPER1在PC9、PC9-GR及PC9-OR细胞中表达位置的变化。为深入探讨新型雌激素受体GPER1在耐药过程中的作用,本研究还通过蛋白质印迹法（western blot）检测了 E2、G1对GPER1在肺癌细胞A549、PC9-OR中表达的影响;运用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测了雌激素受体GPER1对肺癌细胞A549、PC9-OR增殖的影响。[结果]1.Q-PCR法检测到在mRNA水平,GPER1和ERβ在A549细胞中的表达明显高于PC-9细胞,且表达水平接近MCF-7细胞。2.PCR和ddPCR测序法对肺癌细胞株PC9、PC9-GR、PC9-OR进行...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１Ａ?ＥＲｐ在Ａ５４９、ＰＣ９和ＭＣＦ－７细胞中的表达??Ｆｉｇｌ?Ａ?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＲｐ?ｉｎ?Ａ５４９＞?ＰＣ９?ａｎｄ?ＭＣＦ－７?ｃｅｌｌｓ??
２构建对ＴＫＩｓ耐药的肺癌细胞株??２．１在倒置相差显微镜下观察构建的耐药细胞株形态变化??在倒置相差显微镜下观察发现：ＰＣ９，?ＰＣ９－ＧＲ细胞株呈集落样生长，细胞体??积较小，彼此相连聚集成团，外形呈卵圆扁平状，生长速度呈对数生长，具有典??型的上皮样细胞形态；而与前两者相比，加药诱导六个月后的ＰＣ９－０Ｒ细胞形态??发生了明显变化，细胞分散生长，胞质区域明显，体积显著变大，有伪足，见下??图。??ＰＣ９?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??图２?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ的细胞形态??Ｆｉｇ?２?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ??２．２使用ＰＣＲ测序法检测肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ细胞株的ＥＧＦＲ１８－２１??外显子序列??根据ＰＣＲ测序法的检测结果可知，ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ三株细胞中１９??外显子的２４９２－２５０６位点均发生了突变缺失，如下图。我们在细胞培养过程中运??用ＣＣＫ－８法检测到ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ分别对吉非替尼和奥西替尼产生了耐药，??由于ＰＣＲ测序法只能检测到突变丰度大于１０％？２０％的突变，为了进一步检测在??这三个细胞株中是否发生了最常见的Ｔ７９０Ｍ耐药突变，我们运用了精确度更高??的ｄｄＰＣＲ?（可以检测到突变丰度０．１％的突变）来检测其突变情况。??２８??
３新型雌激素受体ＧＰＥＲ１对肺癌耐药细胞Ａ５４９、ＰＣ９－ＯＲ增殖的影响??３．１用免疫荧光技术检测ＧＰＥＲ１在肺癌细胞ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－ＯＲ中的表??达??采用免疫荧光显微镜（２０Ｘ）观察了雌激素受体ＧＰＥＲ１在肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ??及ＰＣ９－０Ｒ细胞株中的表达情况，我们发现在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ细胞中ＧＰＥＲ１均??表达于细胞核中；而在ＰＣ９－ＯＲ细胞株中ＧＰＥＲ１表达于细胞核及细胞质中，见??下图。??ＰＣ９（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??图４?ＧＰＥＲ１在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－０Ｒ细胞中的表达及分布??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＰＥＲ１?ｉｎ?ＰＣ９＞?ＰＣ９－ＧＲ?ａｎｄ?ＰＣ９－０Ｒ?ｃｅｌｌｓ??３．２应用蛋白质印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法）检测Ｅ２及Ｇ１对肺癌细胞Ａ５４９、??ＰＣ９－ＯＲ细胞株中ＧＰＥＲ１表达影响??免疫蛋白印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法）检测结果表明，Ｇｌ、Ｅ２均促进肺癌细??胞株Ａ５４９、ＰＣ９－０Ｒ中的ＧＰＥＲ１的表达，见下图。Ｇ１对ＧＰＥＲ１的表达具有??时间依耐性，在Ａ５４９细胞株中４８小时比２４小时表达高，而在ＰＣ９－ＯＲ细胞株??中２４小时比４８小时表达高（Ｐ＜０．５，有统计学意义）；Ｅ２对ＧＰＥＲ１的表达影响??在０－２４小时随时间变化不明显，在Ａ５４９细胞株中２４、４８小时表达几乎齐平，??且在ＰＣ９－ＯＲ细胞株中２４小时与４８小时也无明显差异（Ｐ＜０．５）。??３０??
本文编号：3478481
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１Ａ?ＥＲｐ在Ａ５４９、ＰＣ９和ＭＣＦ－７细胞中的表达??Ｆｉｇｌ?Ａ?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＲｐ?ｉｎ?Ａ５４９＞?ＰＣ９?ａｎｄ?ＭＣＦ－７?ｃｅｌｌｓ??
２构建对ＴＫＩｓ耐药的肺癌细胞株??２．１在倒置相差显微镜下观察构建的耐药细胞株形态变化??在倒置相差显微镜下观察发现：ＰＣ９，?ＰＣ９－ＧＲ细胞株呈集落样生长，细胞体??积较小，彼此相连聚集成团，外形呈卵圆扁平状，生长速度呈对数生长，具有典??型的上皮样细胞形态；而与前两者相比，加药诱导六个月后的ＰＣ９－０Ｒ细胞形态??发生了明显变化，细胞分散生长，胞质区域明显，体积显著变大，有伪足，见下??图。??ＰＣ９?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ?（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??图２?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ的细胞形态??Ｆｉｇ?２?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ??２．２使用ＰＣＲ测序法检测肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ细胞株的ＥＧＦＲ１８－２１??外显子序列??根据ＰＣＲ测序法的检测结果可知，ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－０Ｒ三株细胞中１９??外显子的２４９２－２５０６位点均发生了突变缺失，如下图。我们在细胞培养过程中运??用ＣＣＫ－８法检测到ＰＣ９－ＧＲ、ＰＣ９－ＯＲ分别对吉非替尼和奥西替尼产生了耐药，??由于ＰＣＲ测序法只能检测到突变丰度大于１０％？２０％的突变，为了进一步检测在??这三个细胞株中是否发生了最常见的Ｔ７９０Ｍ耐药突变，我们运用了精确度更高??的ｄｄＰＣＲ?（可以检测到突变丰度０．１％的突变）来检测其突变情况。??２８??
３新型雌激素受体ＧＰＥＲ１对肺癌耐药细胞Ａ５４９、ＰＣ９－ＯＲ增殖的影响??３．１用免疫荧光技术检测ＧＰＥＲ１在肺癌细胞ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－ＯＲ中的表??达??采用免疫荧光显微镜（２０Ｘ）观察了雌激素受体ＧＰＥＲ１在肺癌ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ??及ＰＣ９－０Ｒ细胞株中的表达情况，我们发现在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ细胞中ＧＰＥＲ１均??表达于细胞核中；而在ＰＣ９－ＯＲ细胞株中ＧＰＥＲ１表达于细胞核及细胞质中，见??下图。??ＰＣ９（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＧＲ（２００Ｘ）?ＰＣ９－ＯＲ（２００Ｘ）??图４?ＧＰＥＲ１在ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ及ＰＣ９－０Ｒ细胞中的表达及分布??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＰＥＲ１?ｉｎ?ＰＣ９＞?ＰＣ９－ＧＲ?ａｎｄ?ＰＣ９－０Ｒ?ｃｅｌｌｓ??３．２应用蛋白质印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ方法）检测Ｅ２及Ｇ１对肺癌细胞Ａ５４９、??ＰＣ９－ＯＲ细胞株中ＧＰＥＲ１表达影响??免疫蛋白印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法）检测结果表明，Ｇｌ、Ｅ２均促进肺癌细??胞株Ａ５４９、ＰＣ９－０Ｒ中的ＧＰＥＲ１的表达，见下图。Ｇ１对ＧＰＥＲ１的表达具有??时间依耐性，在Ａ５４９细胞株中４８小时比２４小时表达高，而在ＰＣ９－ＯＲ细胞株??中２４小时比４８小时表达高（Ｐ＜０．５，有统计学意义）；Ｅ２对ＧＰＥＲ１的表达影响??在０－２４小时随时间变化不明显，在Ａ５４９细胞株中２４、４８小时表达几乎齐平，??且在ＰＣ９－ＯＲ细胞株中２４小时与４８小时也无明显差异（Ｐ＜０．５）。??３０??
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