全基因组短链非编码RNA文库筛选耐药黑色素瘤细胞及其初步机制研究

发布时间：2021-11-13 10:39

　　目的:黑色素瘤患者对靶向药物容易产生耐药是目前困扰医学界的一大难题。Library文库筛选具有高通量、省时、经济等特点。本研究中,我们利用自主构建的覆盖全基因组短链非编码RNA Library对几株黑色素瘤细进行靶向药物（Vemurafenib）耐药筛选。从药物致死剂量确定,耐药细胞建立,到高通量测序鉴别导致耐药短链非编码RNA,单片段短链非编码RNA验证,生物信息分析等几个方面对黑色素瘤耐受Vemurafenib进行探索。以期能从RNA调控层面对黑色素瘤耐药机制进行一些阐述。方法:细胞培养确定Vemurafenib对几株黑色素瘤细胞的致死剂量。同时包装大量逆转录病毒,感染大量黑色素瘤细胞。增加病毒库中短链非编码RNA多样性的同时,尽量降低同一个细胞感染病毒数,便于后续单片段验证、分析。通过加入Vemurafenib进行多轮压力筛选,经过结晶紫染色、IC50检测、迁移实验、流式细胞周期、q-PCR等方法确定耐药细胞的建立。利用二代高通量测序平台Illumina Hi Seq对诱导耐药的短链非编码RNA进行鉴别,并且单片段导入细胞进行验证。此外,通过生物信息学分析和q-PCR对黑色素瘤细... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：107 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

Vemurafenib对Mel-624胞的致死剂量

Vemurafenib对Mel-888胞的致死剂量

为便于实验条件的统一性，在以后的筛选中我们统一使用 15 μM 作为第一轮耐药细胞筛选的剂量。2.2 耐 Vemurafenib 细胞筛选含有 Library 的逆转录病毒感染目的细胞后，在 BSD 和 Vemurafenib 的压力下，经过几轮筛选，我们快速得到高度耐 Vemurafenib 的细胞（图 1-5 ）。每一种耐药细胞的命名为统一在 Patental 细胞后加 “v”，代表 Vemurafenib。没有任何一个 Patental 细胞能在 25 μM 的 Vemurafenib 条件下存活，但是我们筛选出的耐药细胞在 30 μM 的 Vemurafenib 下均有存活。为了比对各组间的定量关系，我们将每个培养皿结晶紫染色后的细胞用 70 %乙醇溶解后进行 100 倍稀释，取 200 μL 放入 96 孔板中进行酶标仪扫描。结果显示，超过 20 μM Vemurafenib 后，Mel-624 和 Mel-888 细胞吸光度基本检测不到；而 A375 细胞的吸光度明显低于 A375v，图 1-6 （P < 0.01）。

【参考文献】：
期刊论文
[1]Evaluation of SNPs in miR-196-a2, miR-27a and miR-146a as risk factors of colorectal cancer[J]. Renata Hezova,Alena Kovarikova,Julie Bienertova-Vasku,Milana Sachlova,Martina Redova,Anna Vasku,Marek Svoboda,Lenka Radova,Igor Kiss,Rostislav Vyzula,Ondrej Slaby.  World Journal of Gastroenterology. 2012(22)



本文编号：3492869