基于G—四链体核酶的乳腺癌外泌体分析方法的研究
发布时间：2021-11-27 10:59
乳腺癌是女性排名第一的恶性肿瘤,乳腺癌的早期诊断和治疗对增长患者生存期具有重要意义。乳腺癌患者的外周血中除了特殊蛋白、核酸等常规的血清标志物外,还存在一些微尺度的纳米囊泡,研究发现,这些纳米囊泡可作为乳腺癌早期诊断的生物标志物。外泌体是脂质包封的纳米级囊泡中的一种,肿瘤来源的外泌体包含很多癌蛋白、mRNA等肿瘤特异性分子标志物,外泌体可以充当细胞间的分子信使,参与肿瘤细胞和微环境之间的信号传导。此外,由于肿瘤细胞表面外泌体分泌旺盛,且可以从体液中分离出来,因此,在液体活检中,外泌体被认为是一种重要的生物标志物,在癌症的诊断、预后和治疗等方面拥有巨大的潜力。到目前为止,关于外泌体检测的研究已经有很多报道,但是方便、低成本的检测方法还亟待开发。基于此,我们提出了两种省时低耗的外泌体检测方法,一种是利用G-四链体DNA过氧化物模拟酶实现高灵敏度的外泌体检测;第二种方法以不规则的四面体DNA结构为支架,串联天然酶与人工酶（G-四链体）,通过酶级联信号放大实现外泌体检测。本论文的主要研究内容如下:1、基于氯化血红素（hemin）/G-四链体模拟辣根过氧化物酶（HRP）的优越性,我们将高特异性的m...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?１外泌体的结构与组分??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ａｎｄ?ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??
开发了很多检测方法。传统的检测技术主要包括纳米颗??粒跟踪分析（ＮＴＡ）、动态光散射（ＤＬＳ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和流式细胞术等。??１．３．１传统定量方法??１．３丄１?透射电镜（ＴＥＭ）??外泌体的大小和结构可以用通过电子显微镜来鉴定。在生物材料的传统电子显微镜??中，样品制备需要固定、脱水和金属化。样品制备可能会导致样品的损伤（例如，囊泡??可能会瓦解），导致杯状的形貌，而低温电子显微镜显示出完美的特殊结构［１３］，有趣的??是，在二氧化硅纳米粒子上捕获的外泌体（图１．２Ａ），在没有低温固定的情况下仍然保持??球形［４６］，应用免疫金颗粒可以检测到表面生物标志物的存在［４７］。图１．２Ｂ显示了与外泌??体和杯状外泌体膜上的Ｒａｂ５蛋白标记物结合的金纳米颗粒的定位，其大小在３０－３００?ｎｍ??范围内［４８１，外泌体簇的尺寸为３００?ｎｍ。而计算异质样品中外泌体的数量，需要大量的??图像进行评估，这也代表了电子显微镜的实际局限性［４９１。??图１．２外泌体的ＴＥＭ图像（Ａ）捕获的外泌体经ｐＨ为７．１磷钨酸阴性染色后的ＴＥＭ图像（Ｂ）??外切结合外泌体的免疫特性??Ｆｉｇ．?１．２?ＴＥＭ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ?（Ａ）?ＴＥＭ?ｉｍａｇｅ?ｏｆ?ｃａｐｔｕｒｅｄ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ?ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ?ｎｅｇａｔｉｖｅ??ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｐＨ?７．１?ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ?ａｃｉｄ?（Ｂ）?ｉｍｍｕｎｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＥｘｏＣｈｉｐ－ｂｏｕｎｄｅｄ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??
第８页?华东理工大学硕士学位论文??流式细胞术以流式细胞仪为依托，是一种分析细胞表面和细胞内分子（蛋白）表达的??技术６１：，可以测量外泌体的多种表面标记物。简单地说，悬浮在液体中的单分散细胞通??过激光束的路径，每个单元将光偏转到正向（正向散射）或侧向（侧向散射）。探测到的散??射光被转换成与其强度成正比的电压脉冲。通过超速离心法，从骨髓树状的细胞（ＢＭＤＣ）??提取的外泌体（ＢＭＤＣｓ）通过被动吸附被涂布到４?ｊａＭ醛／硫酸乳胶珠上。标记两种不同??荧光的外泌体与抗体进行孵育，图１．３中展示了流式细胞仪的观察结果。与其他技术相??比，流式细胞术的主要优点是可以测量每个外泌体相关的单个或多个表面标记物。??＾?ＡＰＣ－ＬＡＭＰ－１?ａｎｄ??４?ＵｎＳｌａ＇ｎｅｄ?，?ＦＩＴＣ－ＭＨＣ－ＩＩ??个?１０?４０．００?０＾７］?１〇＇?Ｊ１５．４８?６＾６??１０３?￣?１〇３－?．??１０２?ｎ?１０２＂１??ｌ???＾?１０。冬＂和?Ｕ．１?■?＂ｎ??１０°?１〇＇?１〇２?１〇３?１〇４?１０°?１０１?１０２?１０３?１０４??ＦＬ１?？??图１．３抗体标记的－ＢＭＤＣ－外泌体的流式细胞术检测结果??Ｆｉｇ．?１．３?Ｆｌｏｗ?ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ?ｒｅｓｕｌｔ?ｆｏｒ?ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｅｄ－ＢＭＤＣ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??１．３．２夕卜泌体定量新技术??为了提高外泌体检测的灵敏度、速度和效率，研究人员试图建立新的生物传感器用??于检测外泌体，如表面等离子体共振（ＳＰＲ）、表面增强拉曼散射（ＳＥＲＳ）、荧光、电化??学和紫外分光光谱学等检测器。仪器的简易性和生物传感器的普及性使
【参考文献】：
期刊论文
[1]Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes:current perspectives and future challenges[J]. Dinh Ha,Ningning Yang,Venkatareddy Nadithe. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2016(04)
本文编号：3522146
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?１外泌体的结构与组分??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ａｎｄ?ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??
开发了很多检测方法。传统的检测技术主要包括纳米颗??粒跟踪分析（ＮＴＡ）、动态光散射（ＤＬＳ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和流式细胞术等。??１．３．１传统定量方法??１．３丄１?透射电镜（ＴＥＭ）??外泌体的大小和结构可以用通过电子显微镜来鉴定。在生物材料的传统电子显微镜??中，样品制备需要固定、脱水和金属化。样品制备可能会导致样品的损伤（例如，囊泡??可能会瓦解），导致杯状的形貌，而低温电子显微镜显示出完美的特殊结构［１３］，有趣的??是，在二氧化硅纳米粒子上捕获的外泌体（图１．２Ａ），在没有低温固定的情况下仍然保持??球形［４６］，应用免疫金颗粒可以检测到表面生物标志物的存在［４７］。图１．２Ｂ显示了与外泌??体和杯状外泌体膜上的Ｒａｂ５蛋白标记物结合的金纳米颗粒的定位，其大小在３０－３００?ｎｍ??范围内［４８１，外泌体簇的尺寸为３００?ｎｍ。而计算异质样品中外泌体的数量，需要大量的??图像进行评估，这也代表了电子显微镜的实际局限性［４９１。??图１．２外泌体的ＴＥＭ图像（Ａ）捕获的外泌体经ｐＨ为７．１磷钨酸阴性染色后的ＴＥＭ图像（Ｂ）??外切结合外泌体的免疫特性??Ｆｉｇ．?１．２?ＴＥＭ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ?（Ａ）?ＴＥＭ?ｉｍａｇｅ?ｏｆ?ｃａｐｔｕｒｅｄ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ?ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ?ｎｅｇａｔｉｖｅ??ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｐＨ?７．１?ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ?ａｃｉｄ?（Ｂ）?ｉｍｍｕｎｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＥｘｏＣｈｉｐ－ｂｏｕｎｄｅｄ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??
第８页?华东理工大学硕士学位论文??流式细胞术以流式细胞仪为依托，是一种分析细胞表面和细胞内分子（蛋白）表达的??技术６１：，可以测量外泌体的多种表面标记物。简单地说，悬浮在液体中的单分散细胞通??过激光束的路径，每个单元将光偏转到正向（正向散射）或侧向（侧向散射）。探测到的散??射光被转换成与其强度成正比的电压脉冲。通过超速离心法，从骨髓树状的细胞（ＢＭＤＣ）??提取的外泌体（ＢＭＤＣｓ）通过被动吸附被涂布到４?ｊａＭ醛／硫酸乳胶珠上。标记两种不同??荧光的外泌体与抗体进行孵育，图１．３中展示了流式细胞仪的观察结果。与其他技术相??比，流式细胞术的主要优点是可以测量每个外泌体相关的单个或多个表面标记物。??＾?ＡＰＣ－ＬＡＭＰ－１?ａｎｄ??４?ＵｎＳｌａ＇ｎｅｄ?，?ＦＩＴＣ－ＭＨＣ－ＩＩ??个?１０?４０．００?０＾７］?１〇＇?Ｊ１５．４８?６＾６??１０３?￣?１〇３－?．??１０２?ｎ?１０２＂１??ｌ???＾?１０。冬＂和?Ｕ．１?■?＂ｎ??１０°?１〇＇?１〇２?１〇３?１〇４?１０°?１０１?１０２?１０３?１０４??ＦＬ１?？??图１．３抗体标记的－ＢＭＤＣ－外泌体的流式细胞术检测结果??Ｆｉｇ．?１．３?Ｆｌｏｗ?ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ?ｒｅｓｕｌｔ?ｆｏｒ?ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｅｄ－ＢＭＤＣ?ｅｘｏｓｏｍｅｓ??１．３．２夕卜泌体定量新技术??为了提高外泌体检测的灵敏度、速度和效率，研究人员试图建立新的生物传感器用??于检测外泌体，如表面等离子体共振（ＳＰＲ）、表面增强拉曼散射（ＳＥＲＳ）、荧光、电化??学和紫外分光光谱学等检测器。仪器的简易性和生物传感器的普及性使
【参考文献】：
期刊论文
[1]Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes:current perspectives and future challenges[J]. Dinh Ha,Ningning Yang,Venkatareddy Nadithe. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2016(04)
本文编号：3522146
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