短肽B04脂质体的制备及其体外抑制前列腺癌细胞线粒体ATP5B异位表达的研究
发布时间：2022-02-10 13:46
在课题组前期工作中,我们通过噬菌体展示技术获得与人高转移前列腺癌细胞系PC-3M特异性结合的短肽B04,继而反向钓取筛选获得PC-3M细胞膜上与B04特异性结合的目标蛋白ATP5B[1]。ATP5B通常表达于线粒体内膜,在某些细胞中可以异位表达于细胞膜,其功能和异位途经尚不明确,且ATP5B的异位表达与肿瘤的转移能力有相关联系。因此,为阐明肿瘤细胞膜表面ATP5B的具体来源并有效抑制ATP5B的异位表达,本研究拟采用特异性ATP5B配体短肽B04,通过脂质体被细胞摄取的独特机制,建立一种使短肽B04只与线粒体ATP5B结合而不与细胞膜ATP5B结合的方法,特异性封闭线粒体ATP5B,通过蛋白印迹法观察细胞膜表面ATP5B异位表达是否有效下降,从而抑制ATP5B的异位表达。方法:1.制备短肽B04并验证其是否具备噬菌体表面同序列短肽相同的功能根据短肽序列合成一批短肽B04,将制得B04与PC-3M细胞共孵育,通过细胞免疫荧光化学以及蛋白印迹法检测B04与ATP5B的结合能力。2.制备包裹短肽B04的脂质体并建立B04的HPLC检测方法（1）通过逆相蒸发法制备包裹B0...
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1短肽B04封闭细胞膜ATP5B荧光图（****p<0.0001，n=3）
吉林大学硕士学位论文20图3.1.2短肽B04封闭ATP5B蛋白印迹图（***p<0.001，n=3）A:Westernblot检测PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封闭后ATP5B蛋白表达B:PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封闭后ATP5B蛋白表达统计结果3.2合成B04脂质体并验证其性能3.2.1HPLC建立B04标准曲线我们采用HPLC来建立标准曲线，采用的是DAD检测器检测B04标准品溶液在220nm下的吸光度，并根据其峰面积和样品浓度，我们可以建立出标准曲线公式y=77.08*x+7.139，并算出R方大于0.999。实验结果如下图所示：表3.2.1B04标准品不同浓度梯度及HPLC峰面积图3.2.1B04标准品标准曲线3.2.2HPLC检测B04脂质体包封率包封率是检测脂质体包裹情况的重要参数，越高的包封率代表着药物在脂质体内包裹的量越多，相对分布在溶液中的药物就会少。我们通过游离B04的峰面积和B04标准品样品浓度（ug/mL）01.252.5510203040峰面积（mAU*s）085183387813155623073075
第3章结果21破乳B04的峰面积，带入标准曲线公式，计算出相应浓度再通过包封率公式得出采用逆向蒸发法所制备的B04脂质体的包封率为44.1%，处于正常水平。图3.2.2短肽B04吸收峰图A:游离短肽B04的吸收峰图B:破乳后总短肽B04的吸收峰图3.3B04脂质体对PC-3M细胞的影响3.3.1ATP生成检测试剂盒检测B04脂质体对PC-3M细胞ATP生成的影响在我们研究B04脂质体对线粒体上ATP5B异位表达的影响之前，我们需要先验证该脂质体及其包裹药物含量对ATP合酶的功能没有影响，即ATP生成不能受损。因此，我们使用ATP生成检测试剂盒检测在使用B04脂质体后，PC-3M细胞胞内ATP生成的是否有明显变化。实验分组为空白PC-3M组（不加B04脂质体）、加脂质体空载体PC-3M组、加梯度B04脂质体PC-3M组（10-100ug/mL），以PC-3M组作为对照组。实验结果如下图所示，空载体组相对于对照组没有明显的变化，说明空载脂质体对ATP生成没有影响；10-50ug/mL浓度组相对于对照组没有明显的变化，100ug/mL浓度组相对于对照组有轻微下降，不过并无统计性差异（p>0.05），因此说明较低浓度进入细胞内部的B04短肽并不影响胞内ATP合酶的功能。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2013年中国老年人群恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 陈万青,郑荣寿,张思维,曾红梅,邹小农,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2017 (01)
博士论文
[1]人前列腺癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定[D]. 夏阳.吉林大学 2007
硕士论文
[1]Cav-1在细胞膜异位表达ATP5B促进乳腺癌细胞迁移、侵袭过程中的作用研究[D]. 周莉娟.吉林大学 2019
[2]细胞膜表面ATP5B的表达对肿瘤细胞侵袭转移能力影响的研究[D]. 唐辰晨.吉林大学 2018
[3]ATP5B在细胞膜异位表达对人前列腺癌细胞转移能力的影响及机制探究[D]. 常晓娜.吉林大学 2017
[4]短肽B04对前列腺癌转移相关蛋白ATP5B特异性抑制作用的研究[D]. 李改云.吉林大学 2016
本文编号：3618993
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1短肽B04封闭细胞膜ATP5B荧光图（****p<0.0001，n=3）
吉林大学硕士学位论文20图3.1.2短肽B04封闭ATP5B蛋白印迹图（***p<0.001，n=3）A:Westernblot检测PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封闭后ATP5B蛋白表达B:PC-3M,PC-3M+200ug/mLB04封闭后ATP5B蛋白表达统计结果3.2合成B04脂质体并验证其性能3.2.1HPLC建立B04标准曲线我们采用HPLC来建立标准曲线，采用的是DAD检测器检测B04标准品溶液在220nm下的吸光度，并根据其峰面积和样品浓度，我们可以建立出标准曲线公式y=77.08*x+7.139，并算出R方大于0.999。实验结果如下图所示：表3.2.1B04标准品不同浓度梯度及HPLC峰面积图3.2.1B04标准品标准曲线3.2.2HPLC检测B04脂质体包封率包封率是检测脂质体包裹情况的重要参数，越高的包封率代表着药物在脂质体内包裹的量越多，相对分布在溶液中的药物就会少。我们通过游离B04的峰面积和B04标准品样品浓度（ug/mL）01.252.5510203040峰面积（mAU*s）085183387813155623073075
第3章结果21破乳B04的峰面积，带入标准曲线公式，计算出相应浓度再通过包封率公式得出采用逆向蒸发法所制备的B04脂质体的包封率为44.1%，处于正常水平。图3.2.2短肽B04吸收峰图A:游离短肽B04的吸收峰图B:破乳后总短肽B04的吸收峰图3.3B04脂质体对PC-3M细胞的影响3.3.1ATP生成检测试剂盒检测B04脂质体对PC-3M细胞ATP生成的影响在我们研究B04脂质体对线粒体上ATP5B异位表达的影响之前，我们需要先验证该脂质体及其包裹药物含量对ATP合酶的功能没有影响，即ATP生成不能受损。因此，我们使用ATP生成检测试剂盒检测在使用B04脂质体后，PC-3M细胞胞内ATP生成的是否有明显变化。实验分组为空白PC-3M组（不加B04脂质体）、加脂质体空载体PC-3M组、加梯度B04脂质体PC-3M组（10-100ug/mL），以PC-3M组作为对照组。实验结果如下图所示，空载体组相对于对照组没有明显的变化，说明空载脂质体对ATP生成没有影响；10-50ug/mL浓度组相对于对照组没有明显的变化，100ug/mL浓度组相对于对照组有轻微下降，不过并无统计性差异（p>0.05），因此说明较低浓度进入细胞内部的B04短肽并不影响胞内ATP合酶的功能。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2013年中国老年人群恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 陈万青,郑荣寿,张思维,曾红梅,邹小农,赫捷. 中华肿瘤杂志. 2017 (01)
博士论文
[1]人前列腺癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定[D]. 夏阳.吉林大学 2007
硕士论文
[1]Cav-1在细胞膜异位表达ATP5B促进乳腺癌细胞迁移、侵袭过程中的作用研究[D]. 周莉娟.吉林大学 2019
[2]细胞膜表面ATP5B的表达对肿瘤细胞侵袭转移能力影响的研究[D]. 唐辰晨.吉林大学 2018
[3]ATP5B在细胞膜异位表达对人前列腺癌细胞转移能力的影响及机制探究[D]. 常晓娜.吉林大学 2017
[4]短肽B04对前列腺癌转移相关蛋白ATP5B特异性抑制作用的研究[D]. 李改云.吉林大学 2016
本文编号：3618993
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