MARCH7作为E3泛素连接酶介导β-catenin泛素-蛋白酶体途径降解
发布时间：2022-02-17 08:39
Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展及侵袭转移中具有关键作用。β-catenin与E-cadherin等蛋白形成复合体调控细胞连接和细胞骨架。同时在信号通路调控中,β-catenin可入核行使转录功能,从而促进肿瘤相关基因表达。目前,β-catenin的调控,特别是蛋白稳定性的研究较为清楚。但仍有文献提示β-catenin存在非经典的蛋白稳定性的调控机制。本文从一株突变细胞系中,发现了β-catenin存在不依赖于APC/Axin复合体的非经典降解途径。进一步通过质谱分析互作蛋白寻找到E3泛素连接酶MARCH7。我们发现MARCH7与β-catenin存在互作,并且敲低MARCH7可以增加β-catenin的蛋白水平,过表达MARCH7增加了β-catenin的泛素化降解。通过在线数据库,查找到MARCH7第315位酪氨酸（Y315）存在磷酸化情况。而将其突变为苯丙氨酸F后,MARCH7不能与β-catenin互作并降解β-catenin。在对此位点进行生物信息学分析后,预测出SRC酪氨酸激酶可能为MARCH7上游激酶。在突变细胞系中发现,SRC激活位点Y416磷酸化上调,...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
突变细胞系中β-catenin泛素化降解增加Figure1.2UbiquitinationdegradationwasincreasedinMUTcelllineA.β-catenintimelineexpressionafterCHXtreatmentbywesternblotwithindicated
重庆医科大学硕士研究生学位论文42图1.3MUT细胞系中β-catenin降解不完全依赖经典降解磷酸化位点Figure1.3Degradationofβ-catenininMUTcelllinewasnotentirelydependentonclassicaldegradation-relatedphosphorylationsitesA.Non-phosphorylated（Active）β-cateninexpressionlevelunderMG132treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpressionlevelunderNP-12treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.Totalphosphorylationlevelofβ-cateninbyphos-tagassay.3.1.4MUT细胞系中β-catenin降解不依赖APC/Axin复合体为验证MUT细胞系中β-catenin是否依赖经典模型中的APC/Axin复合体，我们首先使用Wnt信号通路激活剂LiCl[22,23]处理细胞。结果发现在LiCl刺激下，WTMUT以及CL1细胞系的β-catenin均有增加，但LiCl处理组的MUT细胞系的β-catenin水平仍低于另外两组（图1.4A）。同时我们使用新型Wnt/β-catenin激活剂SKL2001来抑制β-catenin与APC/Axin复合体结合后，WT细胞系β-catenin蛋白水平明显增加，而MUT细胞系β-catenin蛋白水平有增加但不如WT组明显且未恢复至WT细胞系同水平（图1.4B）。并且，通过免疫共沉淀实验，我们发现MUT细胞系中β-catenin与Axin1的相互作用能力与WT细胞系保持一致（图1.4C）。因此，我们得出MUT细胞系中β-catenin存在非经典降解方式。
重庆医科大学硕士研究生学位论文43图1.4MUT细胞系中β-catenin降解不依赖APC/Axin复合体Figure1.4Degradationofβ-catenininMUTcelllineindependentofAPC/AxincomplexA.β-cateninexpresslevelunderLiCltreatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpresslevelunderSKL2001treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.InteractionbetweenAxin1andβ-cateninbyIPβ-catenin.3.1.5MUT细胞系中β-catenin在细胞膜与细胞质中减少较细胞核明显β-catenin在细胞中存在细胞膜，细胞质与细胞核[24-26]的三相分布，且各项分布处于动态平衡。在外源刺激的情况下，该平衡会被打破[27]。通过细胞质与细胞核蛋白分离，我们发现在MUT细胞系中，β-catenin在细胞核与细胞质降解均很明显，且在细胞质中降解更为显著（图1.5A）。进一步基于激光共聚焦显微镜的免疫荧光实验可以看到，MUT细胞系的细胞骨架变化明显，且β-catenin在细胞连接处的聚集消失。三项分布情况与核质分离结果相似，即在细胞核中仍可观察到一定量β-catenin的信号。同时，我们还观察到MUT细胞形态较WT细胞有明显变化。
本文编号：3629118
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
突变细胞系中β-catenin泛素化降解增加Figure1.2UbiquitinationdegradationwasincreasedinMUTcelllineA.β-catenintimelineexpressionafterCHXtreatmentbywesternblotwithindicated
重庆医科大学硕士研究生学位论文42图1.3MUT细胞系中β-catenin降解不完全依赖经典降解磷酸化位点Figure1.3Degradationofβ-catenininMUTcelllinewasnotentirelydependentonclassicaldegradation-relatedphosphorylationsitesA.Non-phosphorylated（Active）β-cateninexpressionlevelunderMG132treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpressionlevelunderNP-12treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.Totalphosphorylationlevelofβ-cateninbyphos-tagassay.3.1.4MUT细胞系中β-catenin降解不依赖APC/Axin复合体为验证MUT细胞系中β-catenin是否依赖经典模型中的APC/Axin复合体，我们首先使用Wnt信号通路激活剂LiCl[22,23]处理细胞。结果发现在LiCl刺激下，WTMUT以及CL1细胞系的β-catenin均有增加，但LiCl处理组的MUT细胞系的β-catenin水平仍低于另外两组（图1.4A）。同时我们使用新型Wnt/β-catenin激活剂SKL2001来抑制β-catenin与APC/Axin复合体结合后，WT细胞系β-catenin蛋白水平明显增加，而MUT细胞系β-catenin蛋白水平有增加但不如WT组明显且未恢复至WT细胞系同水平（图1.4B）。并且，通过免疫共沉淀实验，我们发现MUT细胞系中β-catenin与Axin1的相互作用能力与WT细胞系保持一致（图1.4C）。因此，我们得出MUT细胞系中β-catenin存在非经典降解方式。
重庆医科大学硕士研究生学位论文43图1.4MUT细胞系中β-catenin降解不依赖APC/Axin复合体Figure1.4Degradationofβ-catenininMUTcelllineindependentofAPC/AxincomplexA.β-cateninexpresslevelunderLiCltreatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.B.β-cateninexpresslevelunderSKL2001treatmentbywesternblotwithindicatedantibodies.C.InteractionbetweenAxin1andβ-cateninbyIPβ-catenin.3.1.5MUT细胞系中β-catenin在细胞膜与细胞质中减少较细胞核明显β-catenin在细胞中存在细胞膜，细胞质与细胞核[24-26]的三相分布，且各项分布处于动态平衡。在外源刺激的情况下，该平衡会被打破[27]。通过细胞质与细胞核蛋白分离，我们发现在MUT细胞系中，β-catenin在细胞核与细胞质降解均很明显，且在细胞质中降解更为显著（图1.5A）。进一步基于激光共聚焦显微镜的免疫荧光实验可以看到，MUT细胞系的细胞骨架变化明显，且β-catenin在细胞连接处的聚集消失。三项分布情况与核质分离结果相似，即在细胞核中仍可观察到一定量β-catenin的信号。同时，我们还观察到MUT细胞形态较WT细胞有明显变化。
本文编号：3629118
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