miR-101调控CRMP4基因启动子甲基化抑制前列腺癌PC3细胞侵袭与转移的研究
发布时间：2017-05-15 09:00
本文关键词：miR-101调控CRMP4基因启动子甲基化抑制前列腺癌PC3细胞侵袭与转移的研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:课题组前期研究表明:CRMP4是新的前列腺癌转移抑制基因;miR-101可通过下调EZH2的表达,继而上调CRMP4表达,从而抑制前列腺癌细胞的转移。本研究拟探讨前列腺癌PC3细胞系中miR-101对CRMP4基因启动子区甲基化的调控作用以及miR-101上调CRMP4的表达后是否可抑制其在体外的迁移及侵袭能力。方法:采用构建pre-miRNA-101以及siRNA EZH2质粒,使用Lipofectamine2000分别将和转染入PC3细胞中,同时使用可抑制EZH2组蛋白甲基转移酶活性的3-Deazaneplanocin A(DZNep)处理前列腺癌PC3细胞作为对照,采用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测CRMP4基因在前列腺癌PC3细胞中基因启动子甲基化状态的变化。采用划痕实验及transwell评估转染前后的细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:构建pre-miRNA-101以及siRNA EZH2质粒,使用Lipofectamine2000分别将其转染入PC3细胞中,转染效率均大于80%,48h后real-time RT-PCR Pre-miRNA-101组和siRNA EZH2组结果均显示:前列腺癌PC3细胞实验组和阴性及空白对照组相对比,CRMP4 mRNA的表达水平明显上升(P㩳0.05),EZH2 mRNA的表达水平明显下降(P㩳0.05),而阴性对照组和空白对照组比较CRMP4、EZH2的表达量相差不大(P0.05),甲基化特异性PCR(MSP)显示:转染pre-miRNA-101以及siRNA EZH2质粒及DZNEP处理的PC3细胞中CRMP4基因启动子区甲基化程度与对照组细胞相比明显下降(P㩳0.05),而非甲基化程度相差不大(P0.05),细胞划痕实验和Transwell显示细胞的迁移和侵袭能力均明显弱于阴性和空白对照组(P0.05)。结论:(1)miRNA-101表达上调后在前列腺癌PC3细胞中可下调EZH2的表达,从而调控CRMP4基因的DNA甲基化,进而促进CRMP4基因转录,导致CRMP4表达上调。(2)miRNA-101可通过上调CRMP4的表达抑制前列腺癌PC3细胞的侵袭与转移。
【关键词】：前列腺癌 miR-101 CRMP4甲基化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：
- 摘要4-6
- ABSTRACT6-9
- 中英文缩略词表9-10
- 第1章 前言10-13
- 1.1 前列腺癌流行病学10
- 1.2 表观遗传机制调控了前列腺癌CRMP4基因的转录10-11
- 1.3 miR-101调控前列腺癌CRMP4基因转录的探讨11-13
- 第2章 实验材料与方法13-26
- 2.1 材料13-15
- 2.1.1 主要试剂13-14
- 2.1.2 主要仪器和设备14
- 2.1.3 前列腺癌细胞系来源14-15
- 2.2 实验方法及步骤15-25
- 2.2.1 细胞培养15-16
- 2.2.2 转染试剂来源16
- 2.2.3 细胞转染16-17
- 2.2.4 real-time RT-PCR验证转染效率，检测miR-101、CRMP4、EZH2、表达量变化17-19
- 2.2.5 DZNEP药物处理前列腺癌PC3细胞19-20
- 2.2.6 甲基化特异性PCR（MSP）20-24
- 2.2.7 电泳检查MSP产物24
- 2.2.8 细胞划痕实验和Transwell显示细胞的迁移和侵袭能力24-25
- 2.3 统计学方法25-26
- 第3章 结果26-33
- 3.1 各组细胞转染 48h后，荧光显微镜下观察PC3细胞转染效率26-27
- 3.2 转染48h后，，real-time RT-PCR检测转染前后miR-101、EZH2及CRMP4表达量的变化。27-28
- 3.3 DNA提取质量28-29
- 3.4 CRMP4启动子基因MSP扩增结果29-33
- 第4章 讨论33-37
- 第5章 结论37-38
- 致谢38-39
- 参考文献39-43
- 综述 CRMPS家族基因的相关研究进展43-50
- 参考文献48-50
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本文编号：367298
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